Name: optimized pcr-based detection of mycoplasma
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Финансируемая Sigma-Aldrich

1. Обнаружение Mycoplasma <ol><li> Супернатантах клеточных культур можно проверить прямо или образец может подготовленные для использования на более поздний срок. Для подготовки для дальнейшего использования месте 100 мкл надосадочной в стерильную пробирку усиления и инкубировать при температуре 95 ° С в течение 5 минут. После завершения этого образца можно хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Просто перед запуском центрифуги образец кратко (5 секунд) для осаждения любой сотовой мусора. </li><li> Для подготовки образцов для ПЦР, определить общий объем Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / регидратации буфера, который необходим для реакции. Мы будем готовить 5 всего реакций. Пять реакций потребует 2.5μl из Taq и 114.5μl регидратации буфера. Он будет содержать, как минимум, одну единицу Taq в реакцию и 22.5μl регидратации буфер на реакцию образца и отрицательного контроля плюс 24.5μl регидратации буфер для положительного контроля. 1 единица ДНК-полимеразы в реакции следует добавить соответствующий объем регидратации буфера. Это будет меняться с Taq используется. </li><li> Место расчетный объем ДНК-полимеразы Taq в чистую пробирку микроцентрифужных и следовать с расчетным объемом регидратации буфера. ДНК-полимеразы / регидратации буфера следует смешивать аккуратно, щелкая трубки. Эта смесь не следует перемешать. </li><li> Для подготовки отрицательного контроля и образцов использования прозрачных труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. 23 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимераза / Регидратация буфера смеси, подготовленные на предыдущих этапах, должны быть размещены в каждом из отрицательного контроля и образцов труб. Добавить 2 мкл ДНК свободной воде отрицательного контроля и добавить 2 мкл образца к каждой из пробирок с образцами и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать. </li><li> Для подготовки положительного контроля используют розовый труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. Добавьте 25 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / Регидратация буфера микс, подготовленный на предыдущих этапах, чтобы реакция труб и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать. Инкубируйте отрицательного контроля, положительного контроля и пробирок с образцами при комнатной температуре в течение 5 минут. </li><li> Для ПЦР состоится образцы должны быть помещены в термоциклер. При использовании JumpStart Taq активации шаг не требуется. Место реакции труб в термоциклер. Циклы должны быть установлены следующим образом: 94 ° С в течение 30 секунд, 55 ° С в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 40 секунд. Эти циклы будут выполняться 40 раз. </li><li> После ПЦР циклов завершили образцы должны быть охлаждены до 4-8 ° С, удаляя их из термоциклер и размещения их в лед. Когда образцы охлаждением они должны быть загружены на агарозном геле для электрофореза. Загрузка геля и красителя не являются необходимыми, поскольку они уже присутствуют в реакционной трубы. Непосредственно нагрузки 8 мкл каждого ПЦР в отдельную полосу движения. Стоп-электрофореза после миграции на 2,5 - 3,0 см. </li></ol> 2. Представитель Результаты Отрицательный контроль должен показать полосы примерно 481 бп. Это можно увидеть в отрицательном колонки управления на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что активность полимеразы не sufficienttaq использовался недостаточно эффективны. Mycoplasma положительных проб покажет полосы в диапазоне 270 ± 8 б.п.. Полоса будет тяжелым для сильно загрязненных проб и слабый для слегка загрязненных образцов. Вариации интенсивности можно увидеть в положительном колоннами образца на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль, чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы. Если нет полосы в положительном диапазоне или группы в отрицательном диапазоне на образец, это хороший показатель того, что ваши образцы запрещены. Если образец тормозится ПЦР ингибиторов могут быть удалены путем выполнения экстракции ДНК. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> . Рисунок 1 Соответствующие полосы ампликона: Результаты обнаружения микоплазм методом ПЦР показаны. Переулок 2 является отрицательный контроль, который должен показать полосы примерно 481 бп. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что Taq использовался недостаточно эффективны. Mycoplasma-позитивных образцов покажет полосы в диапазоне 270 + 8 б.п., как показано на полосы 3 - 6. Полоса будет HEAиу для сильно загрязненных образцов (дорожка 6) и слабый для слегка загрязненных образцов (дорожка 4). Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль (481 б.п.), чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками Sigma-Aldrich, что производится реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Из-за повышенной чувствительности комплект, когда они выполняются правильно комплект должны дать точные результаты, показывающие, действительно ли ваш образец микоплазмы загрязнения. Комплект был оптимизирован для использования с JumpStart Taq ДНК-полимеразы. Другие taqs могут быть использованы при подготовке образцов, но внутренняя группа контроля на 481 б.п. должны присутствовать, чтобы указать правильный чувствительность альтернативных Taq. Вполне возможно, для положительного полосы проявлять различной плотности в зависимости от уровня загрязнения. Это можно наблюдать отсутствие внутреннего контроля группы на сильно загрязненных проб. Использование осторожности и правильной технике при подготовке образцов для предотвращения загрязнения имеют решающее значение для правильной. Обнаружение при использовании LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma ПЦР Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart Taq ДНК-полимераза </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute крови Геномная ДНК комплект </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Nunc труб усиления </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

Обслуживание без загрязнения клеточных линий имеет важное значение для клеточных исследований. Среди крупнейших загрязнителей опасения микоплазмы загрязнения. Хотя микоплазмы обычно не убивают загрязненные клетки, их трудно обнаружить и может вызвать различные эффекты на культурах клеток, в том числе изменения метаболизма, замедление распространения и хромосомных аберраций. Короче говоря, микоплазмы загрязнения компромиссы стоимость этих клеточных линий в предоставлении точных данных для жизни научных исследований. Источников загрязнения микоплазмы в лабораторных условиях очень сложно полностью контролировать. Поскольку некоторые микоплазмы виды встречаются на коже человека, они могут быть введены из-за плохого асептики. Кроме того, они могут прийти из загрязненных добавки, такие как эмбриональной телячьей сыворотки, и, самое главное из других загрязненных клеточных культурах. Как только микоплазмы загрязняет культуре, он может быстро распространиться на загрязнять других областях лаборатории. Строгое соблюдение надлежащей лабораторной практики, такие как хорошая асептики являются ключевыми, и регулярное тестирование на микоплазму настоятельно рекомендуется для успешной борьбы с микоплазмой загрязнения. ПЦР-выявление микоплазмы стало очень популярным методом для текущего ремонта клеточной линии. ПЦР-методы обнаружения обладают высокой чувствительностью и может обеспечить быстрый результат, что позволяет исследователям быстро реагировать, чтобы изолировать и ликвидировать загрязнение, когда он будет обнаружен, по сравнению с Время, необходимое использованием микробиологических методов. LookOut Mycoplasma ПЦР Kit обладает высокой чувствительностью, с пределом обнаружения всего 2 геномов в мкл. Воспользовавшись весьма специфический JumpStart Taq ДНК-полимеразы и фирменным дизайном грунтовки, ложных срабатываний значительно снижается. Удобные 8-трубки формате, полоски предварительно покрытых дНТФ, и связанные с ними грунтовки позволяет увеличить пропускную способность удовлетворить потребности клиентов с большими коллекциями клеточных линий. Учитывая крайнюю чувствительность комплект, большое внимание должны быть приняты для предотвращения случайного загрязнения образцов и реагентов. Шаг за шагом мы демонстрируем протокол подчеркивает меры предосторожности и практики, необходимых для надежного обнаружения микоплазм. Мы также показываем, и обсудить типичные результаты и их интерпретация. Наша цель заключается в обеспечении успеха исследователей, использующих LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

LookOut Mycoplasma ПЦР Kit используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая устанавливается как метод выбора при высокой чувствительности обнаружения микоплазма, Acholeplasma и Ureaplasma загрязнения в культурах клеток и других клеточных культур производным биологических препаратов.

Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Detection of Protein Ubiquitination

Обнаружение белка убиквитинирования

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Выявление функциональных матриксных металлопротеиназ по Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Оптимизированный протокол для разведения Fopius arisanus, Паразитоид из Tephritid плодовых мух

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Обнаружение модификации гистонов в листьях растений

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Гибкие измерение биолюминесцентных репортеров с использованием автоматизированной продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Имплантация Electrospun сосудистых имплантатов с оптимизированной структурой в мышиной модели

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...