Name: optimized pcr-based detection of mycoplasma
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Financiado por Sigma-Aldrich

1. Detección de Mycoplasma <ol><li> Sobrenadantes de cultivo celular se puede probar directamente, o la muestra se puede preparar para su uso en una fecha posterior. Para prepararse para su uso posterior a cabo 100 l de sobrenadante en un tubo estéril de amplificación y se incuba a 95 ° C durante 5 minutos. Una vez que se completa la muestra se puede almacenar a 2-8 º C durante un máximo de una semana. Justo antes de ejecutar el centrifugar brevemente muestra (5 segundos) para sedimentar los restos celulares. </li><li> Para preparar las muestras para PCR, determinar el volumen total de ADN Taq polimerasa Jumpstart / rehidratación búfer necesario para las reacciones. Vamos a preparar cinco reacciones total. Cinco reacciones requerirá 2.5μl de Taq y 114.5μl de tampón de rehidratación. Este contendrá un mínimo de una unidad de Taq por reacción y 22.5μl de tampón de rehidratación por reacción de la muestra y el control negativo más 24.5μl de rehidratación de amortiguación para el control positivo. 1 unidad de ADN polimerasa por reacción, debe añadirse a la cantidad adecuada de tampón de rehidratación. Esto va a variar con la Taq utilizado. </li><li> Coloque el volumen calculado de la ADN polimerasa Taq en un tubo de microcentrífuga limpio y seguir con el volumen calculado de tampón de rehidratación. La ADN polimerasa / rehidratación buffer se debe mezclar suavemente agitando el tubo. Esta mezcla no debe ser vortex. </li><li> Para preparar el control negativo y las muestras de uso de los tubos de reacción transparente en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. 23 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, debe ser colocado en cada uno de los controles negativos y los tubos de muestra. Añadir 2 l de agua libre de ADN con el control negativo y añadir 2 l de la muestra a cada uno de los tubos de muestra y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex. </li><li> Para preparar el control positivo utilizar los tubos de reacción de color rosa en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. Añadir 25 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, para los tubos de reacción y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex. Incubar el control negativo, control positivo y los tubos de la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Para el PCR a tener lugar las muestras deben ser colocadas en un termociclador. Al utilizar JumpStart Taq un paso de activación no es necesaria. Coloque los tubos de reacción en el termociclador. Los ciclos deben establecerse de la siguiente manera: 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 40 segundos. Estos ciclos se ejecutará 40 veces. </li><li> Una vez que los ciclos de PCR se han completado las muestras deben ser enfriados hasta 4.8 ° C por dejarlas fuera del termociclador y colocarlos en hielo. Cuando se hayan enfriado las muestras que serán cargados en el gel de agarosa para electroforesis. De carga de gel y colorantes no son necesarios puesto que ya están presentes en los tubos de reacción. Directamente carga de 8 l para cada PCR en un carril separado. Detener la electroforesis después de la migración de 2,5 a 3,0 cm. </li></ol> 2. Resultados representante El control negativo debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. Esto se puede ver en la columna de control negativo en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que la actividad de la polimerasa no se sufficienttaq utilizado no fue lo suficientemente sensible. Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 ± 8 pb. La banda será pesada para muestras muy contaminadas y débiles de las muestras ligeramente contaminados. Las variaciones en la intensidad se puede ver en las columnas muestra positiva en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. Todas las muestras contienen un control interno negativo para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas. Si no hay una banda en el rango positivo o una banda en el rango negativo en la muestra de esto es un buen indicador de que sus muestras están inhibidos. Si la muestra se inhibe los inhibidores de la PCR se pueden eliminar mediante la realización de una extracción de ADN. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> Las bandas de la figura 1 amplicón relevantes:. Resultados de la detección de micoplasmas por PCR se muestran. El carril 2 es el control negativo, que debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que el utilizado taq no era lo suficientemente sensible. Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 + 8 pb, como se muestra en los carriles de 3 a 6. La banda se heavy para muestras muy contaminadas (calle 6) y débil para las muestras ligeramente contaminados (calle 4). Todas las muestras contienen un control interno negativo (481 pb) para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

Los autores son empleados de Sigma-Aldrich que producen los reactivos y las herramientas utilizadas en este artículo.

Debido a la extrema sensibilidad de los kit, cuando se realiza correctamente el equipo debe dar resultados precisos que indica si la muestra tiene la contaminación por micoplasma. El kit ha sido optimizado para su uso con la polimerasa de ADN Taq JumpStart. Taqs se pueden usar otros en la preparación de las muestras, pero la banda de control interno en 481 pb, deben estar presentes para indicar la sensibilidad de la alternativa correcta taq. Es posible que las bandas positivas para exponer diferentes densidades en función del nivel de contaminación. Es posible observar la ausencia de la banda de control interno en muestras muy contaminadas. Precaución y utilizando la técnica adecuada en la preparación de las muestras para evitar la contaminación son fundamentales para la correcta. detección cuando se utiliza el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart Taq ADN polimerasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> Genómica GenElute sangre de ADN kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Tubos Nunc amplificación </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

El mantenimiento de líneas celulares libres de contaminación es esencial para la investigación celular. Entre las mayores preocupaciones de los contaminantes son la contaminación por micoplasma. A pesar de micoplasma no suelen matar a las células contaminadas, son difíciles de detectar y pueden causar una variedad de efectos sobre las células cultivadas, incluyendo la alteración del metabolismo, se redujo la proliferación y aberraciones cromosómicas. En resumen, la contaminación por micoplasma compromete el valor de las líneas celulares de proporcionar información rigurosa para la investigación en ciencias biológicas. Las fuentes de contaminación por micoplasma en el laboratorio son muy difíciles de controlar por completo. Como ciertas especies de micoplasmas se encuentran en la piel humana, pueden ser introducidos a través de una técnica aséptica pobres. Además, pueden provenir de los suplementos contaminados, tales como el suero bovino fetal, y lo más importante de otros cultivos de células contaminadas. Una vez micoplasmas contaminantes de una cultura, que pueden propagarse rápidamente a contaminar otras áreas del laboratorio. Estricto cumplimiento de buenas prácticas de laboratorio, tales como una buena técnica aséptica son fundamentales, y las pruebas de rutina para micoplasma es muy recomendable para el éxito del control de la contaminación por micoplasma. PCR basado en la detección de micoplasma se ha convertido en un método muy popular para el mantenimiento rutinario línea celular. Métodos basados ​​en PCR de detección son muy sensibles y pueden dar resultados rápidos, lo que permite a los investigadores para responder rápidamente a aislar y eliminar la contaminación una vez que se detecta en comparación con el tiempo necesario utilizar las técnicas microbiológicas. El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR es muy sensible, con un límite de detección de sólo dos genomas por microlitro. Tomando ventaja de la polimerasa de ADN altamente específicas JumpStart Taq y un primer diseño patentado, los falsos positivos se reducen considerablemente. El práctico formato de 8 tubos, tiras pre-recubiertos con dNTPs, primers y asociados ayuda a aumentar el rendimiento para satisfacer las necesidades de los clientes con grandes colecciones de líneas celulares. Dada la extrema sensibilidad del kit, el gran cuidado se debe tomar para prevenir la contaminación accidental de las muestras y reactivos. El protocolo de paso a paso se demuestra destaca las precauciones y prácticas necesarias para la detección de micoplasma fiable. También mostrar y discutir los resultados típicos y su interpretación. Nuestro objetivo es asegurar el éxito de los investigadores que utilizan el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha establecido como el método de elección para la mayor sensibilidad en la detección de contaminación por Mycoplasma, Acholeplasma y Ureaplasma en cultivos celulares y cultivo celular otros derivados biológicos.

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Investigación

Biología

Detection of Protein Ubiquitination

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Un protocolo optimizado para cría Fopius arisanus, Un parasitoide de moscas de fruta tefrítidas

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Implantación de injertos vasculares Electrospun con estructura optimizada en un modelo de rata

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...