Name: pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian dugesia japonica
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica at JoVE.com

Arbetet i labbet stöds av NSF (MCB0919933) och NIH (GM088790).

1. Trunk fragment förnyelse analys <ol><li> Sluta mata en kohort av maskar i minst 5 dagar innan regenerativ analysen för att se till djuren är fria från avfall och intagen föda (~ 30 intakta maskar, varje mask ~ 8-10 mm långa post-svält). </li><li> På dagen för analysen, skölj en pre-frusen planat is skål med vatten och täcka de fasta iced ytan med plastfolie. Använd pincett, placera ett filterpapper på plastfolie. </li><li> Fukta filtret papper med några droppar källvatten. Överför planarians på filter (&lt;20 maskar per filter) med hjälp av en pipett. Maskar kan flyttas på filtret, om nödvändigt, genom repipetting mer källvatten. Ta bort överflödig vätska. </li><li> Med hjälp av en skalpell, amputera huvudet med ett enda snitt görs ungefär halvvägs mellan den främre spetsen av djuret och den främre änden av svalget (Figur 1A). </li><li> Med hjälp av en skalpell, amputera svansen regionen genom ett enda snitt görs ungefär halvvägs mellan svansen slutet av djuret och bakre änden av svalget (Figur 1A). Ta bort överflödigt slem på skalpellen med en pappershandduk fuktad med 70% etanol efter kapning. Torka överskott etanol från skalpell. </li><li> Överför filtret via pincett i en petriskål (100 x 25mm djup) som innehåller källvatten. Vänta ~ 3 minuter (för tillslutning av sår, observeras av en klämmande och mörkfärgning av såret). </li><li> Skölj trunk fragment från filterpapper i petriskål som innehåller önskat medium för regenerativ analysen och överföring till thermostatted inkubator (24 ° C). </li><li> Betyg regenerativ fenotypen efter ~ 1 vecka, då regenereras strukturer kan identifieras (Figur 1A). </li></ol> 2. Farmakologisk manipulation av regenerering: bipolaritet framkallas av prazikvantel <ol><li> Förbered prazikvantel (PZQ) lager av solubilizing drogen i DMSO (62.4mg PZQ i 1ml för 200mm lager). Används på samma dag. </li><li> Gör 50mL av läkemedel som innehåller lösning (90 mikroM PZQ) i buffrad Montjuch salter. Vortex för ~ 1 minut för att säkerställa spridning. </li><li> Utför stammen fragment regenerativ analys som beskrivs ovan [protokoll # 1], utsätta en kohort av stammen fragment till PZQ vid det sista steget [1,7]. </li><li> Efter 24-48 timmar, utbyte PZQ innehåller medier för källvatten, tvätt maskar flera (&gt; 3) gånger. </li><li> Återgå maskar till inkubatorn. Betyg bipolaritet (två huvuden, Figur 1B) en vecka efter kapning. </li></ol> 3. Genetisk manipulation av regenerering: in vivo RNAi utfodring protokoll <ol><li> Före analysen förbereda homogenatet kycklinglever. Kasta fet, gul färgade sektioner från livsmedelslager och puré återstående levern. Filtrera puré genom maskorna sil och delprov suspension för lagring (1,5 mL rör, -20 ° C). </li><li> Före analysen förbereda nötkreatur röda blodkroppar (RBC) genom alikvotering utbudet till 1 mL prover, förvaras vid -20 ° C. </li><li> Välj maskar för RNAi. Tre kohorter används: gen, positiv kontroll (genen med kända RNAi fenotyp, Figur 1C, D &amp; E) och negativ kontroll (genen utan RNAi fenotyp, även användbar för bedömning av ÖVERVÄLDIGANDE nivåer jämfört med experimentella kohort). För varje årskull, använd ~ 250 maskar (~ 8-10 mm långt efter att svälta i minst 5 dagar). Förvaras i källvatten i plast badkar. </li><li> För varje RNAi årskull, tina lager av E. coli uttrycka dsRNA riktade genen av intresse [8], tillsammans med en tub kycklinglever homogenatet [3,1] och en tub med röda blodkropparna [3,2]. </li><li> Pellet bakterier (13.000 g, 1 minut). Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, kassera supernatanten, placera pellets på is. </li><li> Skapa ett stort hål P200 pipettspetsen genom att skära bort i slutet av spetsen. Grundligt resuspendera bakteriella pelleten i en blandning av kycklinglever homogenatet (150 mikroliter) och röda blodkropparna (50 mikroliter) för att skapa RNAi utfodring mix. Avlägsna luftbubblor genom centrifugering. </li><li> För utfodring, ta bort merparten av vattnet från plastbalja innehåller maskar (lämna ~ 1 cm djup). Swirl badkar att koncentrera maskar i centrum för denna behållare och pipettera RNAi utfodring blanda i en cirkel corralling maskar. Använd en överföringspipett att noga lirka rymlingar tillbaka på RNAi utfodring mix, utan störande andra gästerna! </li><li> Efter utfodring (~ 1 timme), identifiera planarians som matas väl. Dessa maskar visar en djupröd färg från intas RBK. Släng andra. </li><li> Sätt försiktigt utfodring lösning med friskt källvatten, minimera störningar för att förhindra egestion av mat. För att göra detta genom att försiktigt lokalisera maskar på ena sidan av röret med hjälp av en pipett utgjuta grumligt vatten, och försiktigt ersätta med friskt vatten hälls ner den motsatta väggen i badkaret. Resubmerge planarians snabbt som långvarig exponering för luft resulterar också i livsmedel egestion. </li><li> Löst seal behållaren lock och återgå till inkubatorn (24 ° C) </li><li> Upprepa RNAi utfodring protokoll över flera cykler (~ 2-3 dagars mellanrum), varvat med regenerativ cykler [protokoll # 1] till skärmen för RNAi fenotyper. Ett standardprotokoll för utfodring och förnyelse effektivt för många gener visas i figur 2, som tar ~ 1 månad i sammanlagt minst. </li></ol> Ändra detta system för olika gener, som optimal protokoll kommer att bero på faktorer såsom mRNA stabilitet, vävnad, protein perdurance eller utveckling av en fenotyp som hindrar flera utfodring cykler efter förnyelse. Bedöm ÖVERVÄLDIGANDE nivåer genom att helt enkelt screening för penetrans av fenotyp (om det uppenbara), eller genom qPCR metoder för att jämföra riktade mRNA nivåer med negativ kontroll kohorten. 4. Representativa resultat: Stammen fragmentet förnyelse analysen är robust så att alla maskar ska regenerera med normal anterior-posterior (&quot;huvud till stjärt&quot;) polaritet. Detta kan görs så snart som fem dagar efter styckning, vilket underlättas av uppkomsten av den främre eyespots (asterixed, Figur 1A). Dock uppstår fullständig morfologiska restaurering av förlorade strukturer efter en vecka. Farmakologisk manipulation av bålen fragment förnyelse av PZQ att ge två-hövdade maskar (Figur 1B) är också robusta (EC 50 = 87 (+ -) 11% bipolär fragment, 70μM PZQ 48 timmar 20). Bipolaritet sker över en enda regenerativ cykel. Lägre effekt i dessa analyser handlar sannolikt problem med läkemedels löslighet och / eller lagring eller användning av en annan plattmask arter där PZQ är ineffektivt. För läkemedel med lägre penetrans, är en anteriorization index används ofta för att göra mål mellanliggande fenotyper bortsett från komplett bipolaritet 22. Fenotyper följd av RNAi av den positiva kontrollen konstruktioner visas i figur 1: RNAi av Dugesia japonica sex-1 (D j-sex-1) resulterar i en eyeless fenotyp 23 (Figur 1C), RNAi av Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) resulterar i en förlust av ljuset motvilja svar 24 (figur 1D) och RNAi av Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulterar i en två-hövdad fenotyp 16-19, 21 från stammen fragment (Figur 1E). Dessa fenotyper kan uppnås med hjälp av följande enkla RNAi protokoll: Dj-sex-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), där F = utfodring cykel och x = regenerativa cykeln respektive. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1:... Trunk fragment förnyelse analys A Vänster, Image of planarian (överst) och schematiska (mitten) för att visa platsen för exciderad bålen fragment Höger, tidsförloppet för bål fragment förnyelse visar utseendet på regenererande fragment vid olika tider (dagar) B Bild på två huvuden planarian produceras av PZQ exponering. C eyeless &quot;masken producerat av Dj-sex-1 RNAi. D Förlust av ljus motvilja svar i orörliga Dj-PC2 RNAi maskar (färgas röd), jämfört med mobila kontrollrum mask (målat grön). E bipolär planarian producerad av Dj-βcatenin-1 RNAi. I vara, är den ursprungliga främre änden av RNAi maskar orienterade till vänster. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2: Sekvens av utfodring och styckning cykler för typiska RNAi-protokoll som består av flera utfodringar (F), och regenerativ cykler (x) som är effektivt för ÖVERVÄLDIGANDE av många gener i D. japonica. Ändring av detta protokoll för enskilda gener kan behövas för att ge optimalt resultat, till exempel med hjälp av ett färre (parentes) eller ett större antal utfodring och regenerativ cykler.

<ol>
	<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 .</li><li>Robb, S. M., Ross, E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD:+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li><li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+in+planarian+regeneration.">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li><li>Adell, T., Cebri&#224;, F., Sal&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis.">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration.">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li><li>Newmark, P. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+needed+for+regeneration,+stem+cell+function,+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria.">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li><li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians.">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li><li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development.">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians!.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!.</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li><li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Model+Organisms.">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li><li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians:+translations+to+mammals.">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li><li>S&#225;nchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration.">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li><li>Gurley, K. A., Rink, J. C., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis.">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li><li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Hedgehog/Patched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling.">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration.">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li><li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Sal&#243;, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians.">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li><li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2++channel+beta+subunits:+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity.">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li><li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration.">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li><li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration.">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li><li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Djeyes+absent+(Djeya)+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1.">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li><li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+(CNS)+revealed+by+neuronal+cell+markers.">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

De protokoll som beskrivs här ingående analyser för att studera och manipulera förnyelse av planarian Dugesia japonica. De är enkla och inte kräver specialiserad utrustning så att de lätt kan utföras i laboratoriet eller i klassrummet. Analyser kan utföras individuellt eller i kombination (för kemisk genetisk screening av läkemedel effektivitet i vivo) och kan utföras på den kandidat gennivå, eller är anpassningsbara till objektiva, högre throughput screening 8. Vare sig för att studera spännande biologi planarians i sin egen rätt, eller för att bedöma in vivo-funktionen av däggdjur homologer i en alternativ modell för att studera vävnadsregenerering, bör dessa metoder katalysera intresse från en rad olika forskare.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Leverantör </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Källvatten </td><td> Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> Andra former av källvatten fungerar bra också. Trial först i lönsamheten analyser. </td></tr><tr><td> 1 x buffrad Montjuich salter: NaCl (1,6 mm), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1 mm), MgCl2 (0.1mm), KCl (0.1mm), NaHCO3 (1,2 mm), HEPES (1,5 mm). pH 7,4 vid 24 ° C. </td><td> Flera leverantörer </td><td> n / a </td><td> Konstgjord vatten läkemedelsbehandling under regenerativ analyser för att säkerställa pH buffring. 5 / 8 Holtfreter lösning är ett alternativ. </td></tr><tr><td> 2xYT Broth </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Media = 31 g / L. Autoklaveras. </td></tr><tr><td> Petriskål (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Bostäder maskar under regenerering cykler </td></tr><tr><td> Square Dish (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11A </td><td> Fyll med vatten, frysa till is fack används som mask skärytan </td></tr><tr><td> Plastbalja: Ziploc Twist &#39;n Loc (16oz). </td><td> Olika återförsäljare </td><td> n / a </td><td> Praktisk vattentät behållare för RNAi kohorterna </td></tr><tr><td> Kycklinglever </td><td> Kommersiella livsmedelsbutik </td><td> n / a </td><td> Inriktning mot organisk leveranser, på grund av undvikande av antibiotika. </td></tr><tr><td> Stavmixer </td><td> Alla kök leverantör </td><td> n / a </td><td> Används för att göra puré kycklinglever </td></tr><tr><td> Wire 1mm Mesh sil </td><td> Alla kök leverantör </td><td> n / a </td><td> Används för ansträngande puré kycklinglever </td></tr><tr><td> Bovin röda blodkroppar </td><td> Lampire biologiska laboratorier </td><td> 7240807 </td><td> 100% tvättad och poolade RBC fjädring </td></tr><tr><td> Cirkulär filterpapper </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Överföringspipett </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Sterila, kirurgiska knivar </td><td> Flera leverantörer </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Prazikvantel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4668 </td><td> Förvara pulver alikvoter i mörker vid 4 ° C. Uttorka. </td></tr><tr><td> Dj-sex-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi positiv kontroll för &quot;eye-mindre&quot; fenotyp 23 </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> RNAi positiv kontroll för två-hövdade fenotyp 17 </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi positiv kontroll för förlust av ljus motvilja fenotyp 24 </td></tr></tbody></table>

pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian dugesia japonica

Fritt levande planarian Plattmaskar har en lång historia av experimentell användning på grund av deras märkliga regenerativ förmåga 1. Små fragment censurerade från dessa djur reformera den ursprungliga kroppen planen, efter förnyelse av saknade kroppens strukturer. Till exempel om en &quot;stam&quot; fragment är gjord av ett intakt mask, en ny &quot;chef&quot; kommer regenerera anteriorly och en &quot;svans&quot; att regenerera posteriort återställa den ursprungliga &quot;head-to-tail&quot; polaritet av kroppens strukturer före amputation (Figur 1A). Regenerering styrs av planarian stamceller, så kallade &quot;neoblasts&quot; som differentieras till ~ 30 olika celltyper under normal kropp homeostas och verkställas vävnadsregenerering. Detta regenerativ process är robust och lätt att demonstrera. På grund av invigningen av flera banbrytande Labs, många verktyg och funktionella genetiska metoder har nu optimerats för denna modell system. Därför har avsevärda senaste framsteg gjorts i att förstå och manipulera de molekylära händelser som ligger till grund planarian utvecklande plasticitet 2-9. Det planarian Modellen systemet kommer att vara av intresse för ett brett spektrum av forskare. För neuroforskare, ger modellen möjlighet att studera förnyelse av hela nervsystemet, snarare än bara återväxt / reparation av enstaka nervceller process som vanligtvis står i fokus för studien i många etablerade modeller. Planarians uttrycka en uppsjö av signalsubstanser 10, utgör ett viktigt system för att studera utvecklingen av det centrala nervsystemet 11, 12 och har beteendestörningar screening potential 13, 14. Regenerativ utfall kan bli föremål för manipulation av farmakologiska och genetiska apparoaches. Till exempel kan läkemedel screenas för effekter på förnyelse genom att helt enkelt placera kroppen fragment i läkemedelsutveckling lösningar som innehåller vid olika tidpunkter efter amputation. Den roll enskilda gener kan studeras med ÖVERVÄLDIGANDE metoder (in vivo RNAi), vilket kan uppnås antingen genom cykler av mikroinjektion eller utfodras bacterially-uttryckta dsRNA konstruerar 8, 9, 15. Båda metoderna kan producera visuellt slående fenotyper vid hög penetrans, till exempel upprustning av bipolär djur 16-21. För att underlätta införandet av denna modell och genomförandet av sådana metoder, visa vi i detta protokoll videon artikeln för farmakologiska och genetiska tester (in vivo RNAi genom att mata) med planarian Dugesia japonica.

Watch this Scientific Journal Video about Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica at JoVE.com

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

En attraktiv modell för att studera differentiering stamceller i ett levande djur är planarian plattmask. Regenerering studeras med enkla amputation experiment som enkelt kan utföras i ett grundläggande laboratorium och kan bli föremål för farmakologiska och genetiska (<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) manipulation som beskrivs av protokoll i denna artikel.

Farmakologiska och funktionella genetiska analyser för att manipulera Regenerering av Planarian Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Light/dark Transition Test for Mice

Ljus / mörk Transition Test för möss

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikala Neurogenesis: Övergång från Förskott i laboratoriet för att cellbaserade terapier

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay för Neural induktion i Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Elevated Plus Maze for Mice

Förhöjda Plus Maze för möss

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissekering av hippocampus dentate gyrus från vuxen mus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

En allel-specifika Gene Expression analys för Testa funktionell grund av genetiska samband

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Planarian Immobilisering, partiell bestrålning, och vävnadstransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...