この作品は、健康補助金GM086822、希望心臓研究所基礎科学賞、そしてMJマードック公益信託の大学の科学研究開発プログラムの国民の協会によって資金を供給された。電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、寛大にBio - Rad社から提供されました。

1。機能的なGRを含む細胞質ゾルの調製<ol><li>テクニカルノート：特に断りのない限り、すべてのバッファは、遠心分離およびインキュベーションを含むこのプロトコルの冷蔵及び各ステップ、あるべきは、氷の上または4℃で行ってください。低温では、GRとタンパク質の複合体の劣化を防ぐために不可欠です。 </li><li>冷却遠心機を使用して、機能的なGRの高濃度を表すセルの〜1〜5ミリリッ...

<ol>
	<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery.">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery:+implications+for+clinical+intervention.">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li><li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts.">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li><li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+steroid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate.">Reconstitution of the steroid receptor&#149;hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li><li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system.">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li><li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry,+abundance,+and+functional+significance+of+the+hsp90/hsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate.">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li><li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation.">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li><li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery.">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li><li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes.">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation.">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket.">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones.">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li><li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor.">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li><li>Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li><li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Protein+Ubiquitination.">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&amp;bull;Hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&amp;bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry.">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li><li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+(Chk1)+and+the+progesterone+receptor+(PR).">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li><li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway.">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li></ol>

上記のアッセイは、hsp90/hsp70-basedシャペロンの機械だけでなく、GRステロイド結合のシャペロンの行動に影響を与える条件の無数をテストするために適応させることができます。それは以前に報告された方法4,8,9,17の修正であり、電気泳動技術の最近の進歩を活用し、より広い研究コミュニティにアクセスできるように設計されています。関心の追加の補助因子やタンパク質は、ステ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> Sf9昆虫細胞</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td>組換えマウスのGRのバキュロウイルス発現用</td></tr><tr><td> L929細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td>内因性マウスGR細胞質ゾルの調製（バキュロウイルス発現の代替）のための</td></tr><tr><td> FiGRハイブリドーマ細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> （精製BuGR2抗体の代わりに）抗GRモノクローナル抗体を含む腹水を調製するための</td></tr><tr><td>完全なミニプロテアーゼ阻害剤、EDTA -フリー</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td>プロテインA -セファロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ網状赤血球ライセート</td><td>グリーンエーカー（オレゴン州、ウィスコンシン州） </td><td></td><td>内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械の豊富な源</td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3755 </td><td> ATP -再生系のための</td></tr><tr><td>クレアチンリン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7936 </td><td> ATP -再生系のための</td></tr><tr><td>抗GRのマウスモノクローナル抗体（BuGR2） </td><td>ピアース/サーモサイエンティフィック</td><td> MA1 - 510 </td><td> GR免疫吸着に使用し、ウェスタンブロッティングのような一次抗体</td></tr><tr><td>抗HSP90マウスモノクローナル抗体（AC88） </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ADI - SPA - 830 </td><td>ウェスタンブロット法で一次抗体として使用</td></tr><tr><td>抗HSP70マウスモノクローナル抗体（N27F3 - 4） </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ADI - SPA - 820 </td><td>ウェスタンブロット法で一次抗体として使用</td></tr><tr><td>マウス血清からのIgG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 038K7690 </td><td>免疫吸着の負の制御のための非免疫抗体として使用</td></tr><tr><td>抗マウスIgG -ペルオキシダーゼコンジュゲート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4416 </td><td>ウェスタンブロッティングで二次抗体として使用</td></tr><tr><td> Experionマイクロ流体電気泳動システム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 7007001 </td><td>従来のSDS - PAGEの代替</td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H]デキサメタゾン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET1192001MC </td><td>安全上の注意に従ってください</td></tr></tbody></table>

biochemical reconstitution of steroid receptor&#x2022;hsp90 protein  complexes and reactivation of ligand binding

Hsp90は、細胞周期に関与する転写因子（例えば核内受容体は、p53）およびプロテインキナーゼ（例えば、Srcの、Rafが、Aktキナーゼ）を含む150以上の真核生物のシグナル伝達タンパク質を、調節することが認可されていますが不可欠と非常に豊富な分子シャペロンタンパク質です。腫瘍形成、アポトーシス、および複数の真核生物のシグナル伝達経路の1,2。 HSP90のためのこれらの多くの&quot;クライアント&quot;タンパク質のうち、ステロイド受容体の組み立て•HSP90複合体（ 図1）定義されているベストです。ここでは、順応性グルココルチコイド受容体（GR）免疫沈降アッセイを提示し、容易に真核生物のHSP90の機能的活性、HSP90を介したステロイド受容体のリガンド結合、および分子シャペロンの補因子の要件を調べるために使用される体外 GR•Hsp90の再構築の方法で 。例えば、このアッセイは、Hsp90の補因子の要件と再構成のプロセスに外因性化合物を追加した場合の効果をテストするために使用できます。 受容体はステロイド3にアクセス可能なクレフトオープンリガンドの結合を持つことがHSP90にバインドする必要があるため、GRは、HSP90を研究するための特に有用なシステムとなっています。内因性、リガンド非結合GRは非共有結合的にHSP90に結合した哺乳動物細胞の細胞質に存在​​しています。内因性のGR•Hsp90のヘテロ複合体に見られるように、溝GRのリガンド結合は、オープンと結合ステロイドが可能です。 HSP90 GRから解離し、またはその機能が阻害されている場合、受容体はステロイド結合することができず、ステロイド結合アクティビティの前にGR•HSP90ヘテロ複合体の再構成を必要とする、4を復元している場合。 GRは、モノクローナル抗体を用いて細胞質ゾルから免疫沈降、およびウェスタンブロットによりアッセイすることができるようなHSP90のようなタンパク質は、GRに複合することができます。免疫沈降したGRのステロイド結合活性は[3 H]ステロイドでimmunopelletをインキュベートすることによって決定することができます。 以前の実験では、間隙GRのリガンド結合は、真核細胞の生存にも欠かせない第二の分子シャペロンをHSP70が必要なのHsp90 -介した開口部を示している。 HSP90とHSP70の生化学的活性はコシャペロンタンパク質のホップ、HSP40、およびp23の5によって触媒される。 HSP90、HSP70、ホップ、及びHSP40を含む多タンパク質シャペロンの機械は、真核細胞の細胞質内で内在的に存在し、網状赤血球は、シャペロンの豊富なタンパク質源6が用意されています。 提示方法では、GRは細胞質ゾルからimmunoadsorbedさとマイルドな塩条件を用いて内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械を剥奪。塩取り除かれたGRは、網状赤血球ライセート、ATP、およびステロイド結合活性7のGR•Hsp90のヘテロ複合体と再活性化の再構成で、その結果、K +、とインキュベートされる。このメソッドは、8月11日 HSP90を介したステロイド結合にその機能的意義を判断するために、様々なシャペロン補助因子、新規タンパク質、および実験的なHSP90またはGR阻害剤の効果をテストするために利用することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃ¢â‚¬Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding at JoVE.com

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

不定冠詞<em&gt; in vitroで</em•HSP90蛋白質複合体蛋白質と細胞のライセートを精製から機能的なグルココルチコイド受容体（GR）を調製するための&gt;方法が記載されている。方法は、塩ストリッパとタンパク質複合体再構成が続く組換えGRの免疫吸着を利用しています。コファクターとバッファーの条件の重要性は、潜在的なメソッドのアプリケーションなので、説明されています。

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

示差走査蛍光光度を用いたタンパク質 - リガンド相互作用の定量

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...