Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM086822, Coração Esperança Instituto Básico de Ciências prêmio, eo MJ Murdock Charitable Confiança Colégio Programa de Pesquisa em Ciências. Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram generosamente fornecidos pela Bio-Rad.

1. Preparação do citosol da célula contendo GR funcional <ol><li> Nota técnica: Todos os buffers deve ser refrigerado e cada passo deste protocolo, incluindo centrifugação e incubação, deve ser realizada no gelo ou a 4 ° C, salvo indicação em contrário. A baixa temperatura é essencial para prevenir a degradação dos complexos GR e proteínas. </li><li> Usando uma centrífuga refrigerada, obter um ~ 1-5 ml pellet de células que expressa uma alta concentração de GR funcional. Exemplos de fontes de célu...

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	<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery.">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery:+implications+for+clinical+intervention.">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li><li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts.">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li><li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+steroid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate.">Reconstitution of the steroid receptor&#149;hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li><li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system.">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li><li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry,+abundance,+and+functional+significance+of+the+hsp90/hsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate.">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li><li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation.">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li><li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery.">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li><li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes.">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation.">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket.">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones.">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li><li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor.">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li><li>Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li><li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Protein+Ubiquitination.">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&amp;bull;Hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&amp;bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry.">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li><li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+(Chk1)+and+the+progesterone+receptor+(PR).">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li><li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway.">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li></ol>

O ensaio descrito acima pode ser adaptado para testar uma miríade de condições que afetam as ações chaperone da máquina chaperone hsp90/hsp70-based bem como GR ligação de esteróides. É uma modificação dos métodos previamente relatado 4,8,9,17 e é projetado para tirar vantagem dos avanços recentes em tecnologia de eletroforese e ser acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Cofatores adicionais ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao GR • hsp90 mistura reconstituição hete...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Células de inseto Sf9 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> para a expressão de baculovírus recombinante GR do mouse </td></tr><tr><td> L929 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> para valores endógenos do mouse GR citosol preparação (alternativa à expressão baculovírus) </td></tr><tr><td> Células de hibridoma FiGR </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> para preparar ascite contendo anti-GR anticorpo monoclonal (alternativa ao purificada de anticorpos BuGR2) </td></tr><tr><td> Mini completa-inibidor da protease, EDTA-livre </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> proteína A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lisado de reticulócitos de coelho </td><td> Hectares verde (Oregon, WI) </td><td></td><td> fonte rica de máquinas chaperone endógena hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> creatinafosfoquinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> para ATP-Sistema de regeneração </td></tr><tr><td> fosfocreatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> para ATP-Sistema de regeneração </td></tr><tr><td> anti-GR anticorpo monoclonal (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> usado para GR imunoadsorção e anticorpos como primário em mata-borrão ocidental </td></tr><tr><td> anti-hsp90 anticorpo monoclonal (AC88) </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilizado como anticorpo primário no oeste blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp70 anticorpo monoclonal (N27F3-4) </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilizado como anticorpo primário no oeste blotting </td></tr><tr><td> IgG de soro de rato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> utilizado como anticorpo não imunes para o controle negativo de imunoadsorção </td></tr><tr><td> anti-IgG de rato conjugado com peroxidase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> utilizado como anticorpo secundário no oeste blotting </td></tr><tr><td> Experion sistema de eletroforese microfluídicos </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativa ao convencional SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexametasona </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> seguir as precauções de segurança </td></tr></tbody></table>

biochemical reconstitution of steroid receptor&#x2022;hsp90 protein  complexes and reactivation of ligand binding

Hsp90 é uma proteína chaperone essenciais e muito abundantes molecular que foi encontrado para regular a mais de 150 eucarióticas proteínas sinalizadoras, incluindo fatores de transcrição (por exemplo, receptores nucleares, p53) e proteínas quinases (por exemplo, Src, Raf, Akt cinase) envolvidas no ciclo celular, tumorigênese, apoptose e sinalização 1,2 múltiplos eucarióticas caminhos. Muitos desses &#39;cliente&#39; proteínas para hsp90, a montagem de receptores de esteróides • hsp90 complexos é o melhor definidos (Figura 1). Nós apresentamos aqui um receptor adaptável glicocorticóides (GR) ensaio de imunoprecipitação e in vitro GR • O método de reconstituição hsp90 que pode ser facilmente utilizado para investigar a atividade hsp90 eucarióticas funcional, hsp90 mediada ligante receptor esteróide vinculativo, e os requisitos de cofactor molecular acompanhante. Por exemplo, este ensaio pode ser usado para testar hsp90 requisitos cofactor e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição. O GR foi um sistema particularmente útil para estudar hsp90 porque o receptor deve ser ligado a hsp90 de ter uma ligação do ligante fenda aberta que é acessível a 3 de esteróides. GR, endógena unliganded está presente no citoplasma de células de mamíferos não covalentemente ligado a hsp90. Como encontrado no GR endógena • heterocomplex hsp90, a ligação do ligante GR fenda está aberto e capaz de esteróides vinculativo. Se hsp90 se dissocia do GR, ou se a sua função é inibida, o receptor é incapaz de ligar esteróides e requer a reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 antes da atividade de ligação de esteróides é restaurado 4. GR pode ser immunoprecipitated do citosol da célula usando um anticorpo monoclonal, e proteínas como a hsp90 complexado ao GR podem ser analisadas por western blot. Actividade de ligação de esteróides do GR immunoprecipitated pode ser determinada incubando a immunopellet com [3 H] esteróides. Experimentos anteriores mostraram hsp90 mediada abertura da ligação do ligante GR fenda requer hsp70, um segundo chaperone molecular também essencial para a viabilidade das células eucarióticas. Atividade bioquímica de hsp90 e hsp70 são catalisadas por co-chaperone Hop proteínas, hsp40 e p23 5. A acompanhante máquinas multiprotein contendo hsp90, Hop, hsp70, hsp40 e são endogenamente presentes no citoplasma de células eucarióticas, e lisado de reticulócitos fornece um acompanhante rica fonte de proteínas 6. No método apresentado, GR é imunoadsorvido do citosol celular e despojado da máquina chaperone endógena hsp90/hsp70 usando condições sal leve. O GR-sal despojado é então incubadas com lisado de reticulócitos, ATP e K +, o que resulta na reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 e reativação da atividade de ligação de esteróides 7. Este método pode ser utilizado para testar os efeitos de vários cofatores acompanhante, novas proteínas e inibidores experimental hsp90 ou GR, a fim de determinar a sua importância funcional no hsp90 mediada por esteróides 11/08 vinculativo.

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Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Método para preparar receptor glicocorticóide funcional (GR) • hsp90 complexos de proteína purificada a partir de proteínas e lisados ​​celulares é descrito. O método utiliza de imunoadsorção recombinante GR seguido de sal de extracção e reconstituição de proteínas complexas. A importância da co-fatores e condições de buffer são discutidos, assim como as aplicações método potencial.

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Research

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Biology

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