Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences utmärkelse, och MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Välj elektrofores reagenser och bildanalys programvara har generöst tillhandahållits av Bio-Rad.

1. Beredning av cell cytosolen innehåller funktionella GR <ol><li> Teknisk anmärkning: Alla buffertar bör förvaras i kylskåp och varje steg i detta protokoll, inklusive centrifugering och inkubation, bör utföras på is eller vid 4 ° C, om inte annat anges. Den låga temperaturen är nödvändig för att förhindra nedbrytning av GR och proteinkomplex. </li><li> Med hjälp av en kyld centrifug, skaffa en ~ 1-5 ml pellet av celler som uttrycker en hög koncentration av funktionella GR. Exempel på cell källor r...

<ol>
	<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery.">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery:+implications+for+clinical+intervention.">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li><li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts.">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li><li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+steroid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate.">Reconstitution of the steroid receptor&#149;hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li><li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system.">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li><li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry,+abundance,+and+functional+significance+of+the+hsp90/hsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate.">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li><li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation.">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li><li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery.">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li><li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes.">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation.">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket.">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones.">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li><li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor.">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li><li>Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li><li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Protein+Ubiquitination.">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&amp;bull;Hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&amp;bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry.">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li><li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+(Chk1)+and+the+progesterone+receptor+(PR).">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li><li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway.">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li></ol>

Analysen som beskrivs ovan kan anpassas för att testa en myriad av förhållanden som påverkar förkläde agerande hsp90/hsp70-based förkläde maskiner samt GR steroid bindande. Det är en modifiering av tidigare redovisade metoder 4,8,9,17 och är utformad för att dra nytta av de senaste framstegen inom elektrofores teknik och vara tillgänglig för en bredare forskarsamhället. Ytterligare kofaktorer eller proteiner av intresse kan läggas till GR • hsp90 heterocomplex beredning blandning, som beskriv...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Sf9 insektsceller </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> för baculovirus uttryck av rekombinant mus GR </td></tr><tr><td> L929 celler </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> för endogena mus GR cytosolen förberedelse (alternativ till baculovirus uttryck) </td></tr><tr><td> FiGR hybridom celler </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> för att förbereda ascites innehållande anti-GR monoklonal antikropp (alternativ till renat BuGR2 antikropp) </td></tr><tr><td> Komplett-Mini proteashämmare, EDTA-fri </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> protein A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> kanin retikulocyttal lysat </td><td> Grön hektar (Oregon, WI) </td><td></td><td> rik källa av endogena hsp90/hsp70 förkläde maskiner </td></tr><tr><td> kreatinfosfokinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> för ATP-regenererande system </td></tr><tr><td> phosphocreatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> för ATP-regenererande system </td></tr><tr><td> anti-GR mus monoklonal antikropp (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> används för GR immunoadsorption och som primär antikropp i Western blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp90 mus monoklonal antikropp (AC88) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> använts som primär antikropp i Western blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp70 mus monoklonal antikropp (N27F3-4) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> använts som primär antikropp i Western blotting </td></tr><tr><td> IgG från mus serum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> användas som nonimmune antikropp för negativ kontroll över immunoadsorption </td></tr><tr><td> anti-mus-IgG-konjugat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> användas som sekundär antikropp i Western blotting </td></tr><tr><td> Experion mikroflödessystem elektrofores systemet </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativ till konventionella SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexametason </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> följa säkerhetsföreskrifter </td></tr></tbody></table>

biochemical reconstitution of steroid receptor&#x2022;hsp90 protein  complexes and reactivation of ligand binding

Hsp90 är en viktig och mycket rikligt molekylära förkläde protein som har funnit att reglera mer än 150 eukaryota signalering proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer (t.ex. nukleära receptorer, p53) och kinaser protein (t.ex. Src, Raf, Akt kinas) som är involverade i cell cykling, Tumörgenesens, apoptos, och flera eukaryota vägar signalering 1,2. Av dessa många &quot;kund&quot; proteiner för hsp90 och montering av steroidreceptoreffekten • hsp90 komplex är den bästa definieras (Figur 1). Vi presenterar här en anpassningsbar glukokortikoid-receptorn (GR) immunoprecipitation analys och in vitro GR • hsp90 beredning metod som lätt kan användas för att sonden eukaryota hsp90 funktionell aktivitet, hsp90-medierad steroidreceptoreffekten ligandbindande och molekylär förkläde krav kofaktor. Till exempel kan detta test användas för att testa hsp90 kofaktor kraven och effekterna av att lägga exogena substanser till återupprättandet processen. GR har varit ett särskilt användbart för att studera hsp90 eftersom receptorn måste vara bunden till hsp90 att ha en öppen ligandbindande klyfta som är tillgänglig för steroid 3. Endogena, unliganded GR finns i cytoplasman hos däggdjursceller noncovalently bunden till hsp90. Som finns i den endogena GR • hsp90 heterocomplex är GR ligandbindande kluven öppen och kan binda steroid. Om hsp90 dissocierar från GR eller om dess funktion hämmas, är den receptor kan binda steroid och kräver beredning av GR • hsp90 heterocomplex innan steroid bindande aktivitet återställs 4. GR kan immunoprecipitated från cell cytosolen med hjälp av en monoklonal antikropp, och proteiner som hsp90 komplexbundet till GR kan analyseras med Western blot. Steroid bindande aktivitet immunoprecipitated GR kan bestämmas genom inkubering av immunopellet med [3 H] steroid. Tidigare försök har visat hsp90-medierade öppnandet av GR kluven ligandbindande kräver hsp70, en andra molekylär förkläde också viktigt för eukaryota cellernas livskraft. Biokemiska aktivitet hsp90 och hsp70 katalyseras av co-förkläde proteiner Hop, hsp40 och P23 5. En Multiproteinkomplex förkläde maskiner som innehåller hsp90, hsp70, Hop, och hsp40 är endogent närvarande i eukaryota cellens cytoplasma, och retikulocytantal lysat ger ett förkläde rik proteinkälla 6. I den presenterade metoden är GR immunoadsorbed från cell cytosolen och fråntagen den endogena hsp90/hsp70 förkläde maskiner med mild salt förhållanden. Saltet-avskalade GR inkuberas sedan med retikulocyttal lysat, ATP, och K +, vilket resulterar i beredning av GR • hsp90 heterocomplex och reaktivering av steroid bindande aktivitet 7. Denna metod kan användas för att testa effekterna av olika förkläde kofaktorer, proteiner roman, och experimentella hsp90 eller GR-hämmare för att fastställa deras funktionella betydelse för hsp90-medierad steroid bindande 8-11.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃ¢â‚¬Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding at JoVE.com

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

En<em&gt; In vitro</em&gt; Metod för att bereda funktionella glukokortikoid-receptorn (GR) • hsp90 proteinkomplex från renade proteiner och cellulära lysates beskrivs. Metoden utnyttjar immunoadsorption av rekombinanta GR följt av salt-strippa och proteinkomplex beredning. Betydelsen av co-faktorerna och villkor buffert diskuteras, liksom möjliga metod applikationer.

Biokemiska Ombildning av steroidreceptoreffekten • Hsp90 proteinkomplex och Reaktivering av ligandbindande

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biokemiska Titrering av glykogen<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Fastställande av protein-ligand interaktioner Använda Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In vitro Beredning of Light-skörd Komplex av växter och gröna alger

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Tillväxt baserade Bestämning och biokemisk Bekräftelse av genetiska Krav för proteinnedbrytning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiska och biokemiska metoder för<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Bedömning av Protein Oligomerisering: ryanodin Receptor Fallstudie

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...