Name: automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
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यह काम स्वास्थ्य अनुदान GM086822 और राष्ट्रीय विज्ञान प्रमुख अनुसंधान उपकरण अनुदान DBI 0,960,313 फाउंडेशन के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों के लिए डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. जॉन मियाके और डोना हार्डी (जैव रेड) और उनकी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए जेनिफर Loertscher (सिएटल विश्वविद्यालय). क्रोमैटोग्राफी अभिकर्मकों का चयन करें और पूरक उपकरण उदारता जैव रेड द्वारा प्रदान किया गया.

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	<li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interaction+chromatography.">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li><li>Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+modeling+of+nonlinear+hydrophobic+interaction+chromatographic+systems.">Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).</li><li>To, B. C., Lenhoff, A. 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C., Banh, C., Brossay, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.A+Protocol+for+the+Production+of+KLRG1+Tetramer.">L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer.</a> J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. 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क्रोमैटोग्राफी अभिकर्मकों का चयन करें और पूरक उपकरण जैव रेड द्वारा प्रदान किया गया.

तरल क्रोमैटोग्राफी तकनीक उच्च शुद्ध 6 प्रतिरक्षाविज्ञानी के संचालन के लिए आवश्यक, जैव रासायनिक 7 प्रोटीन की तैयारी, और संरचनात्मक 8 अध्ययन के लिए अमूल्य साबित किया है. एचआईसी शोधन तरीकों सबसे अक्सर एक पसंदीदा माध्यम के अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है, और ligand संरचना, ligand के घनत्व, और मैट्रिक्स मनका गुण सब chromatographic 2 परिणाम, 3 प्रभाव दिखाया गया है. स्वचालित स्काउटिंग स्तंभ बाद अनुकूलन और प्रोटीन 4 शुद्धि के लिए एक एचआईसी मध्यम का चयन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है. स्वचालित स्तंभ स्काउटिंग प्रस्तुत विधि आसानी से विभिन्न एचआईसी प्रोटीन शुद्धीकरण रणनीतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. नमक एकाग्रता, नमक की पसंद, नमक ढाल, और पीएच में बदलाव और शुद्धि स्थितियों में सुधार हो सकता है और इन आवश्यक मापदंडों को अलग करने का प्रभाव पहले से किया गया है 13,14 की समीक्षा की. एचआईसी एक आंशिक रूप से शुद्ध लक्ष्य prote युक्त प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलकमें आगे जा आयन एक्सचेंज (आईईएक्स) क्रोमैटोग्राफी या जेल / निस्पंदन आकार अपवर्जन 9,10 क्रोमैटोग्राफी के रूप में एक पूरक chromatographic तकनीक का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं. अपनी अनूठी प्रकाश absorbance के उत्सर्जन और विशेषताओं की वजह से, GFP की प्रोद्धावन प्रोफ़ाइल में लाइन और बाद रन दृष्टिकोण का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. कि अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आगे रीकॉम्बीनैंट GFP-संलयन प्रोटीन की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो में एक असंबंधित लक्ष्य के प्रोटीन GFP साथ है &quot;टैग&quot;. GFP टैग लक्ष्य प्रोटीन यूवी प्रकाश 11 और एचआईसी शुद्धि ऊपर वर्णित रणनीति सहित विभिन्न chromatographic दृष्टिकोण, का उपयोग शुद्ध के साथ पता लगाया जा सकता है. GFP शुद्धि भी आधुनिक प्रोटीन विज्ञान 12 तकनीकों के शिक्षण के लिए जैव रसायन प्रयोगशालाओं में एक शैक्षणिक प्रधान बन गया है. जबकि बुनियादी एचआईसी प्रोटीन शुद्धि एक काफी कम मजबूत क्रोमैटोग्राफी sy का उपयोग किया जा सकता हैस्टेम, उपकरण यहाँ प्रस्तुत करने के लिए अनुकूल परिणाम प्राप्त करने में सहायता के लिए विशिष्ट लाभ का एक संख्या है. एक अत्यधिक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने का उल्लेखनीय लाभ रन रन हालत reproducibility है, समय की बचत में सुधार शामिल हैं, और 10 प्रणाली में पेश किया जाना हवा के लिए अवसरों की कमी हुई. सिस्टम नियंत्रित बफर सम्मिश्रण, जो प्रणाली दल से मदद की है, के बफर तैयारी और प्रयोगात्मक reproducibility के में वृद्धि की स्थिरता के लिए अनुमति देता है. सभी स्काउटिंग के लिए गतिशील नमूना पाश में पर्याप्त नमूना लोड ड्राइंग चलाता आगे नमूना प्रत्येक स्तंभ के लिए जोड़ा जा रहा है की एकरूपता सुनिश्चित करता है और रुकावट या reloading के मैनुअल के बिना अनुक्रमिक रन के लिए अनुमति देता है. स्तंभ पर नमूना पाश से नियंत्रित नमूना इंजेक्शन परिवर्तनशीलता कि मैनुअल नमूना लोड हो रहा है के साथ हो सकता है कम हो जाती है. स्तंभ चयन वाल्व की एक जोड़ी लगातार नमूना रन, प्रत्येक एक अलग एचआईसी स्तंभ का उपयोग करने के लिए, लिए प्रणाली replumb बिना अनुमति देते हैं. एमयूएल प्रदर्शन<html> ती - तरंग दैर्ध्य विश्लेषण विशेष रूप से लाभकारी है जब एक अद्वितीय spectrophotometric प्रोफ़ाइल के साथ एक प्रोटीन परख करने की क्रिया है. GFP के अलावा, cytochromes, flavoproteins,, और अन्य heme युक्त प्रोटीन इस तकनीक से फायदा हो सकता है. चालकता और पीएच निगरानी उपकरणों वास्तविक समय प्रयोगात्मक शर्तों के सत्यापन के लिए अनुमति देते हैं. भाजित अंश प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक संग्रह सुधार अंश से निपटने के लिए अनुमति देता है और बाद चलाने के विश्लेषण के तरीकों कि एक न्यूनतम नमूना मात्रा (जैसे एलिसा, एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी धब्बा, और Experion microfluidic के वैद्युतकणसंचलन) की आवश्यकता के लिए आसान हस्तांतरण के लिए सक्षम बनाता है. जबकि दूसरे अंश कलेक्टर ऑफ़लाइन ऑपरेटिंग पुस्तिका तुल्यकालन की आवश्यकता है, यह अंश कलेक्टर चयन में अधिकतम लचीलेपन के लिए अनुमति देता है. एचआईसी स्काउटिंग स्तंभ और प्रोटीन शुद्धि के लिए इस तरह के एक मजबूत क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कमियां प्रारंभिक समय और बजट साधन अधिग्रहण और ऑपरेटर के प्रशिक्षण के साथ जुड़े व्यय शामिल हैं. टी &quot;&gt; यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक जैव रेड DuoFlow, क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का इस्तेमाल करता है, तथापि, जीई हेल्थकेयर से ÄKTA Avant के रूप में अन्य निर्माताओं, से समान रूप से मजबूत उपकरण भी उपयोग किया जा सकता है और बराबर परिणाम का निर्माण करने में सक्षम हैं भी तुलनीय क्रोमैटोग्राफी प्रणाली अद्वितीय विशेषताओं (उदाहरण के लिए विधि प्रोग्रामिंग, घटक नामकरण, ऑपरेटर वरीयता, scalability और सीमाओं) है कि एक शुद्धिकरण की प्रक्रिया या साधन अधिग्रहण शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक का नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">जीवविज्ञान DuoFlow सलाई सिस्टम 20</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> दल प्रणाली, मिक्सर, F10 वर्कस्टेशन, वाल्व AVR7-3, QuadTec / यूवी विज़ डिटेक्टर प्रवाह सेल, BioFrac का अंश कलेक्टर, जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर के साथ, और स्टार्टर किट शामिल </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8 धारा चयन वाल्व</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> उच्च दबाव वाल्व, 9 बंदरगाह, 8 की स्थिति, जीवविज्ञान DuoFlow प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए 3500 (233 बार) साई सीमा, </td></tr><tr><td> Diverter SV3T दो वाल्व </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> 7600410 </td><td> Solenoid वाल्व, 3 बंदरगाह, 2 की स्थिति, जीवविज्ञान DuoFlow प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए 30 (2 बार) साई सीमा, </td></tr><tr><td> स्ट्रीम अलगानेवाला वाल्व </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>राजनैतिक = एलएसआर parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;DynaLoop 25 किट </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> नमूना पाश किट स्लाइडिंग पिस्टन, 25 मिलीलीटर की रपट DynaLoop पिस्टन पाश, DynaLoop भागों किट (750-0,450 #) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFrac भिन्न कलेक्टर</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> दो अंश कर्नल<html> lectors इस्तेमाल किया </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac microplate ड्रॉप सिर एडाप्टर</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac microtiter प्लेट अनुकूलक</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td>7410017&gt; और देश = अमेरिकी &amp; lang = hi &amp; ProductID = 741-0017 &quot;लक्ष्य =&quot; &quot;_blank </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">यूवी प्रकाशिकी मॉड्यूल</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">हलोजन दीपक</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> &lt;<html> एक = &quot;_blank&quot; 7601331&gt; लक्ष्य </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo ग्रेडियेंट पम्प</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> कम दबाव प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए ढाल पंप, टयूबिंग और फिटिंग किट </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion सिस्टम</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad अध्यक्ष तथा प्रबंध निदेशक = BRCatgProductDetail ProductID = 224,301 &quot;लक्ष्य =&quot; &quot;_blank&gt; 7,007,001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 विश्लेषण किट</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">जैव - रेड</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap एचआईसी स्तंभ चयन किट </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> 28-4110-07 </td><td> 7 x स्काउटिंग के लिए 1 मिलीग्राम पूर्व पैक एचआईसी मीडिया के स्तंभ शामिल </td></tr><tr><td> जीई हेल्थकेयर को जैव रेड स्तंभ फिटिंग </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> 18111251 और 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

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Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

उपयुक्त हाइड्रोफोबिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HIC) प्रोटीन शुद्धीकरण की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा मीडिया की पहचान के लिए एक स्वचालित तरीका प्रस्तुत किया है. विधि एक तरल माध्यम दबाव क्रोमैटोग्राफी स्वचालित बफर सम्मिश्रण, गतिशील नमूना पाश इंजेक्शन, अनुक्रमिक स्तंभ चयन, बहु तरंगदैर्ध्य विश्लेषण के, और विभाजन अंश प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक संग्रह सहित प्रणाली का उपयोग किया जाता है.

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In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

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Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान<em&gt; ड्रोसोफिला</emअग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि द्वारा&gt; वयस्क प्रमुखों (नल)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन सहभागिता वाली साइटों की पहचान

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (पीसीए) द्वारा जीनोम चौड़ा प्रोटीन प्रोटीन सहभागिता स्क्रीनिंग

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...