Name: automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
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この作品は、健康補助金GM086822と国立科学財団の主要な研究助成金計装DBI-0960313の国立研究所によって資金を供給された。著者は、博士に感謝します。ジョン·三宅＆ドナハーディ（Bio-Rad社）とその技術的専門知識のためにジェニファーLoertscher（シアトル大学）。クロマトグラフィー用試薬を選択し、補足的な計装は、寛大にBio-Rad社によって提供されました。

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クロマトグラフィー用試薬を選択し、補足的な計装は、Bio-Radから提供されました。

液体クロマトグラフィー技術は、7生化学的免疫学6を行うために必要な高度に精製したタンパク質、および構造的な8つの研究を準備するために貴重な実証されています。 HICの精製方法は、ほとんどの場合、好ましい培地の経験的判断を必要とし、配位子の構造、リガンド密度、マトリックスビーズのプロパティはすべてのクロマトグラフの結果は2、3に影響を与えることが示されている。スカウト自動化された列は、その後の最適化とタンパク質精製4 HIC培地を選択するための効率的なアプローチである。提示自動化されたカラムスカウティング手法は、容易に様々なHICタンパク質の精製戦略に適合させることができます。塩濃度、塩の選択は、塩勾配、およびpHの変化は、さらに精製条件を向上させることができ、これらの必須のパラメータを変えることの効果は以前に13,14日されています。部分的に精製されたターゲットproteを含むHIC溶出液には、さらに、イオン交換クロマトグラフィー（IEX）またはゲル濾過/サイズ排除クロマトグラフィー9,10などの補完的なクロマトグラフィー技術を用いて精製することができます。 そのユニークな光の吸光度および発光特性の、GFPの溶出プロファイル内の行と、実行後のアプローチを使用して識別することができます。そのために、このプロトコルは、さらに関係のない目的タンパク質がGFPで &quot;タグ付け&quot;されている、組換えGFP融合タンパク質の精製に適応することができます。 GFPタグ付きの標的タンパク質は、UV光11と、上記HIC精製戦略を含む様々なクロマトグラフィー手法を用いて精製して検出することができます。 GFPの精製はまた、近代的な蛋白質科学技術の12の教育のための生化学ラボで教育主食となっています。 基本的なHICタンパク質の精製は、実質的に少ない堅牢なクロマトグラフィーSYを用いて行うことができますが、ステムは、ここで紹介するインストルメンテーションは、良好な結果を得ることを支援するために、異なる多くの利点があります。高度に自動化システムを利用しての顕著な利点は、改善·実行·実行するために条件の再現性、時間を節約し、システム10に導入される空気の機会を減少させたが含まれています。システム·マキシマイザーにより促進されるシステム制御バッファブレンディングは、バッファの準備と実験の再現性に増加した一貫性を可能にします。スカウトは、さらに実行するすべての動的なサンプルループに十分なサンプルの負荷を描画すると、サンプルの均一性は、各列に追加され確保され、中断、または手動でリロードすることなく、順次実行を可能にします。カラムにサンプルループから制御された試料注入は、手動でサンプルロードで発生する可能性がありばらつきが減少します。カラム選択バルブのペアは、それぞれのシステムをreplumbすることなく、異なるHICカラムを使用して、連続したサンプルの実行が可能になります。 MULを実行する<html>ユニークな分光プロファイルを使用して蛋白質を測定する時TI-波長分析では、特に有益です。 GFPに加えて、シトクロム、flavoproteins、および他のヘム含有タンパク質は、この技術の恩恵を受ける可能性があります。伝導度とpHモニタリングデバイスは、リアルタイムの実験条件の検証を可能にします。分割分数溶出コレクションは改善された分画処理を行うことができ、最小限のサンプル量（例えば、ELISA、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、とExperionマイクロ流体電気泳動）を必要と実行後の分析手法について簡単に転送できます。第二のフラクションコレクタをオフラインで操作すると手動で同期を必要とするが、それはフラクションコレクタの選択に最大の柔軟性を可能にします。 HICスカウトカラムとタンパク質の精製のためにそのような堅牢なクロマトグラフィーシステムを活用した最も重要な欠点は、楽器の収集とオペレータのトレーニングに関連付けられている最初の時間と予算の支出が含まれています。 T &quot;&gt;ここで紹介するプロトコルは、Bio-Rad社DuoFlowクロマトグラフィーシステムを利用します。。しかし、このようなGEヘルスケアからÄKTAの前衛のような他のメーカーからも同様に堅牢なインストルメンテーションを利用することもできると同等の結果を生成することが可能であっても同等のクロマトグラフィーシステム精製法や楽器の取得を開始する前に考慮すべき固有の特性（例えば、メソッドのプログラミング、コンポーネントの命名法、演算子の優先順位、およびスケーラビリティの制限）があります。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント（オプション） </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">生物学的DuoFlowパスファインダー20システム</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td>システムマキシマイザー、ミキサー、F10のワークステーション、AVR7-3バルブ、フローセル、BioFracフラクションコレクター、生物学的ソフトウェア、スターターキットを使用QuadTecのUV / VIS検出器を含む</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8ストリーム選択バルブ</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td>生物学的DuoFlowシステムで使用する高圧バルブ、9ポート、8ポジション、3,500 PSI（233バー）の制限、 </td></tr><tr><td>分流弁SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> 7600410 </td><td>生物学的DuoFlowシステムで使用する電磁弁、3ポート、2ポジション、30 PSI（2バー）の制限、 </td></tr><tr><td>ストリームスプリッタバルブ</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical = LSR＆parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25キット</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td>スライディングピストンサンプルループ·キット、25ミリリットルのDynaLoopスライディングピストンループ、DynaLoop部品キット（＃750から0450まで）が含まれています</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFracフラクションコレクタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td>二つの分数COL<html>使用lectors </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFracマイクロドロップヘッドアダプタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFracマイクロタイタープレートアダプタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td>＆国=米国＆LANG = EN＆ProductID =に741-0017 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV光モジュール</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">ハロゲンランプ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> &lt;<html> 1ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">エコノグラジエントポンプ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td>低圧タンパク質精製のための勾配ポンプは、チューブと継手キットが含まれています</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experionシステム</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad？CMD = BRCatgProductDetail＆ProductID =に224301 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260分析キット</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td>ハイトラップHICカラム選択キット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-4110-07 </td><td>スカウトのためにHICのメディアの7×1ミリリットルプレパックドカラムが含まれています</td></tr><tr><td> GEヘルスケア·ツー·Bio-Rad社のカラムフィッティング</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18111251と18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification

精製タンパク質（例えば、ゲル濾過、アフィニティー、イオン交換）用の他のクロマトグラフィー法とは対照的に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、一般に最も適したクロマトグラフ媒体を選択するために実験的な決定を（スクリーニングまたは &quot;スカウト&quot;と呼ばれる）が必要です与えられたタンパク質1を精製する 。ここで紹介する方法は、タンパク質精製に使用する最適なHICメディアのスカウトへの自動アプローチを説明します。 HICは、疎水性の差に基づいて粗ライセートからタンパク質などの生体分子を分離しています。アフィニティークロマトグラフィー（AC）とイオン交換クロマトグラフィー（IEX）と同様に、HICは、クロマトグラフィープロセスの進行に応じて、目的のタンパク質を濃縮することができます。最高のHICによる精製に適したタンパク質は、疎水性表面領域を有するものが含まれており、2 Mの弾薬を超える濃度の塩への暴露に耐えることができるnium硫酸塩（（NH 4）2 SO 4）。 HICは、多くの場合、アフィニティタグを欠いているタンパク質の精製法として選択し、ACのため、適さない、とIEXは、十分な精製を提供するために失敗したときにされています。タンパク質表面の疎水性部分は、一時的に不活性、不動のマトリックスに結合された非極性リガンドに結合する。タンパク質とリガンドとの相互作用は、タンパク質-リガンド相互作用を強化し、不動のタンパク質（すなわち、列の内側に結合した2）を作る高イオン濃度で、クロマトグラフィーカラムを通過する緩衝液の塩濃度に大きく依存します。塩濃度が低下すると、タンパク質 - リガンド相互作用は消費電力、タンパク質は再び携帯電話になり、カラムから溶出する。 HIC複数の媒体がプリパックドカラムで市販されている、複数の疎水リガンド（例えばオクチルs-ブチル、ブチルおよびフェニル）のそれぞれ含むものには規格のアガロースビーズに濃度を変化させて架橋タイプIFIC直径3。 HICメディアが将来、より徹底的な最適化の実験やタンパク質精製の ​​ために採用すべきかを決定するための効率的なアプローチは、4を実行するためにスカウト自動化された列ができます。 ここで精製されている特定のタンパク質は、組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）であるが、アプローチは、1つまたは複数の疎水性表面領域と他のタンパク質を精製するために適合させることができる。 GFPは紫外線を5にさらされたとき、その安定性、397 nmでのユニークな吸光度のピークと蛍光による有用なモデルタンパク質として機能します。野生型GFPを含む細菌ライセートは、高塩緩衝液中に調製Bio-Rad社DuoFlow媒体圧力液体クロマトグラフィーシステムにロードされ、異なるHICメディアを含むハイトラップHICカラムに吸着させた。タンパク質はカラムから溶出し、内の行と、実行後の検出法によって分析した。バッファ·ブレンディング、動的なサンプルループ注入、シーケンシャルCOLUMN選択、マルチ波長分析、分割割合溶出コレクションは、実験的アプローチのシステムおよび再現性の機能を増加した。

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Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

タンパク質精製のプロセスで使用される適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）メディアを識別するための自​​動化された方法が示されています。メソッドは、自動化されたバッファ·ブレンディング、動的なサンプルループ注入、順次列の選択、マルチ波長分析、分割割合溶出コレクションなどの中圧液体クロマトグラフィーシステムを利用しています。

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

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ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

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磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

タンパク質の精製で使用するための自動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択