Name: automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concessão GM086822 e National Science Foundation grande pesquisa instrumentação concessão DBI-0960313. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Jon Miyake &amp; Donna Hardy (Bio-Rad) e Jennifer Loertscher (Seattle University), pela sua competência técnica. Seleccionar reagentes de cromatografia e instrumentação suplementar foram generosamente fornecidas pelo Bio-Rad.

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Seleccionar reagentes de cromatografia e instrumentação suplementar foram fornecidos pela Bio-Rad.

Técnicas de cromatografia líquida provaram inestimável para a preparação de proteínas altamente purificadas necessárias para a realização de 6 imunológica, bioquímica 7, e 8 estudos estruturais. Métodos de purificação HIC mais frequentemente requer a determinação empírica de um meio preferido, e estrutura de ligando, a densidade de ligando, e as propriedades da matriz do grânulo todos têm sido mostrados para impacto nos resultados cromatográficas 2, 3. Coluna automatizado de aferição é uma abordagem eficiente para a seleção de um meio de HIC para otimização subseqüente e purificação de proteínas 4. O método automatizado coluna de aferição apresentados podem ser prontamente adaptado para várias estratégias de purificação de proteínas HIC. Alterações na concentração de sal, a escolha do sal, gradiente de sal, e pH pode melhorar ainda mais as condições de purificação, e os efeitos da variação destes parâmetros essenciais foram previamente analisado 13,14. Eluato de HIC contendo uma prote alvo parcialmente purificadain pode ser adicionalmente purificado utilizando uma técnica cromatográfica complementar, tal como cromatografia de permuta iónica (IEX) ou de exclusão em gel de filtração / tamanho cromatografia 9,10. Devido à sua absorvância de luz original e características de emissão, o perfil de eluição de GFP podem ser identificados utilizando, em linha e pós-run abordagens. Para esse efeito, este protocolo pode ainda ser adaptada para a purificação de recombinantes GFP de fusão de proteínas, em que uma proteína-alvo não relacionado é &quot;marcado&quot; com GFP. Proteínas alvo GFP pode ser detectada com luz UV 11 e purificado utilizando várias abordagens cromatográficas, incluindo a estratégia de purificação HIC descrito acima. Purificação GFP também se tornou um marco pedagógico nos laboratórios de bioquímica para o ensino de técnicas de proteína ciência moderna 12. Enquanto a purificação da proteína básica de HIC pode ser conduzida usando uma substancialmente menos robusto cromatografia syhaste, a instrumentação aqui apresentado tem um número de vantagens distintas para auxiliar na obtenção de resultados favoráveis. Benefícios notáveis ​​de se utilizar um sistema altamente automatizado incluem a melhoria executar-a-correr condição de reprodutibilidade, tempo de poupança, e diminuiu oportunidades para o ar a ser introduzidos no sistema 10. Sistema controlado mistura de tampão, o que é facilitado pela maximizer sistema, permite a consistência aumentou na preparação de tampão e reprodutibilidade experimental. Desenho carga de amostra suficiente para a ansa de amostragem dinâmico para todos aferição é executado assegura ainda mais a uniformidade da amostra a ser adicionado a cada coluna e permite que para execuções sequenciais sem interrupção ou manual de recarga. Injecção da amostra controlado a partir do circuito de amostra na coluna diminui variabilidade que pode ocorrer com carregamento manual da amostra. Um par de válvulas de selecção de coluna permitir para execuções de amostra consecutivos, cada um utilizando uma coluna HIC diferente, sem ter de replumb o sistema. Executando mul<html> ti-comprimento de onda de análise é particularmente benéfico quando se examina uma proteína com um perfil único espectrofotométrico. Além disso a GFP, citocromos, flavoproteínas, e outros heme contendo proteínas podem beneficiar deste técnica. Dispositivos de monitorização de condutividade e pH permitir a verificação de tempo real condições experimentais. Dividir recolha eluato fracção permite a manipulação fracção melhorada e permite a transferência fácil para os métodos de pós-executar a análise que requerem um mínimo volume de amostra (por exemplo, ELISA, SDS-PAGE, Western blot, e Experion electroforese microfluídico). Ao operar off-line segundo coletor fração requer sincronização manual, que permite a máxima flexibilidade na seleção de coletores de fração. As desvantagens mais significativas para a utilização como um sistema de cromatografia robusto para a coluna HIC aferição e purificação de proteínas incluem o tempo inicial e as despesas orçamentais associados à aquisição de instrumentos e treinamento do operador. t &quot;&gt; O protocolo apresentado aqui utiliza um Bio-Rad DuoFlow sistema de cromatografia;. no entanto, a instrumentação igualmente robusta de outros fabricantes, tais como o Avant Akta da GE Healthcare, podem também ser utilizados e são capazes de produzir resultados equivalentes sistema de cromatografia Mesmo comparável têm características únicas de programação (por exemplo, limitações, método de nomenclatura de componentes, a preferência do operador, e escalabilidade) que devem ser considerados antes de iniciar um processo de purificação ou aquisição de instrumentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Inclui sistema maximizador, mixer, estação de trabalho F10, AVR7-3 da válvula, QuadTec UV / Vis detector com célula de fluxo, coletor de fração BioFrac, software BioLogic, e kit de iniciação </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8-stream selecionar válvula</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> De alta pressão da válvula, 9-porta, posição 8, 3.500 psi (233 bar) limite, para uso com o sistema DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Desviador válvula SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Válvula de solenóide, 3-porta, posição 2, 30 psi (2 bar) limite, para uso com o sistema DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Stream Splitter válvula </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Sliding pistão kit de amostragem, inclui 25 ml de deslizamento DynaLoop laço pistão, DynaLoop partes kit (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">Coletor de Frações BioFrac</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Dois col fração<html> leitores utilizado </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac microplaca adaptador cabeça queda</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac adaptador placa de microtitulação</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = EUA &amp; lang = pt &amp; ProductID = 741-0017 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">Optics UV Módulo</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Lâmpada halógena</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> um target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Bomba Gradiente</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> bomba de gradiente de baixa pressão purificação de proteínas, inclui tubagem e kit de acessórios </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = 224301 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Kit Análise Pro260</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap kit seleção HIC coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Inclui 7 x 1 ml pré-embalados colunas de mídia HIC para aferição </td></tr><tr><td> GE Healthcare para a Bio-Rad acessórios coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 e 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification

Em contraste com outros métodos cromatográficos para proteínas de purificação (por exemplo, filtração em gel, afinidade e de troca iónica), cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) comumente requer determinação experimental (referido como triagem ou &quot;scouting&quot;), a fim de seleccionar o meio mais adequado para cromatografia para a purificação de uma dada proteína 1. O método aqui apresentado descreve uma abordagem automatizada para aferição para um meio óptimas HIC a serem utilizados na purificação de proteínas. HIC separa proteínas e outras biomoléculas a partir de um lisado bruto com base nas diferenças de hidrofobicidade. Semelhante a cromatografia de afinidade (AC) e cromatografia de permuta iónica (IEX), HIC é capaz de se concentrar a proteína de interesse à medida que progride através do processo cromatográfico. Proteínas mais adequados para a purificação por HIC incluem aqueles com regiões superfície hidrofóbica e capaz de suportar a exposição a concentrações de sal em excesso de 2 ammo Mtitânio sulfato de ((NH4) 2 SO 4). HIC é muitas vezes escolhido como um método de purificação para proteínas que faltam um marcador de afinidade e, portanto, inadequado para AC, e quando IEX não fornecer purificação adequada. Porções hidrofóbicas na superfície da proteína temporariamente se ligar a um ligando não polar acoplado a uma matriz inerte, imóvel. A interacção entre a proteína e do ligando são altamente dependente da concentração de sal do tampão que flui através da coluna de cromatografia, com altas concentrações iónicas reforçar a interacção proteína-ligando e tornando a proteína imóvel (isto é, ligado no interior da coluna) 2. Como diminuir as concentrações de sal, a interacção proteína-ligando dissipa, a proteína torna-se novamente móvel e elui da coluna. Vários meios HIC estão disponíveis comercialmente em pré-embalados colunas, cada uma contendo de vários ligandos hidrofóbicos (por exemplo, S-butilo, butilo, octilo, e fenil) reticulado em diferentes densidades de esferas de agarose de uma especificaçãodiâmetro ific 3. Coluna Automated aferição permite uma abordagem eficiente para determinar que a mídia HIC deve ser empregada para o futuro, experimentos de otimização mais exaustivos e purificação de proteínas é executado 4. A proteína específica a ser purificado é aqui recombinante da proteína verde fluorescente (GFP), no entanto, a abordagem pode ser adaptado para a purificação de outras proteínas com uma ou mais regiões superfície hidrofóbica. GFP serve como um modelo útil proteína, devido à sua estabilidade, único pico de absorvância de luz a 397 nm, e de fluorescência quando exposta à luz UV 5. Lisado bacteriano contendo GFP do tipo selvagem foi preparado de um tampão de elevado teor de sal, carregado num meio DuoFlow Bio-Rad a pressão do sistema de cromatografia líquida, e adsorvido a colunas HiTrap HIC contendo diferentes meios HIC. A proteína foi eluída das colunas e analisadas por in-line e métodos de pós-run de detecção. Mistura de buffer, a injeção de ciclo dinâmico amostra, col seqüencialUMN selecção, multi-comprimento de onda, análise e de divisão de recolha eluato fracção aumentou a funcionalidade do sistema ea reprodutibilidade da abordagem experimental.

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Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Um método automático para a identificação de interacção hidrofóbica adequados cromatografia (HIC) meios de comunicação para ser utilizados no processo de purificação de proteínas é apresentada. O método utiliza um meio de pressão-sistema de cromatografia líquida incluindo mistura de tampão automatizado, injecção lacete dinâmica amostra, a selecção de coluna sequencial, multi-comprimento de onda de análise, e recolha de divisão eluato fracção.

Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

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