Name: visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM086822 المنحة. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. أليك Pakhomov والاس بول (جامعة تقنية النانو واشنطن مرفق المستخدم (NTUF)) واندريا سليد (بروكر AXS) لما قدموه من مساعدة تقنية من الخبراء. وقد أجريت DNA فؤاد التصوير في جامعة. واشنطن NTUF ، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. ويعود الفضل في البلازميد 2xGal4 - 2xGRE - luciferease من قبل المختبر الدكتور كيث ياماموتو (جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).

<ol>
	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

فؤاد يوفر تقنية فريدة من نوعها مجهرية قادرة على الجزيئات الحيوية الفردية غير المصقول في التصوير المائي وقرب حلول فيزيولوجي مخزنة في الوقت الحقيقي. وهذا يسمح للتصور من البروتينات الفردية وجزيئات الحمض النووي ، فضلا عن المجمعات والمجمعات multiprotein بالبروتين الحمض النووي. يمكن أن جزيئات الجزيئات التصوير مع فؤاد مفيدا لتقييم تجانس العينة وتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات ملاحظتها. ويمكن ملاحظة هذا النهج من جزيئات الجزيئات الفردية أن تكون إضافة مفيدة لتقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية ، مثل فحوصات مناعي ، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، واللوني حجم العمود الاستبعاد ، والتي توفر بيانات تلخيصي كبيرة تمثل 10 3 11 -10 مجمعات الجزيئية البيولوجية لمصلحة فرد موجود في العينة. يمكن لجميع البحوث في رياضيات الكيمياء متعدد البروتينات ، والتفاعلات الجزيئية البيولوجية ، ومتطلبات العامل المساعد يتم التحقيق باستخدام فؤاد. ويمكن تكييف الطريقة المعروضة هنا لاستيعاب الأسئلة البيوفيزيائية محددة من الفائدة. على سبيل المثال ، وذلك باستخدام مسبار خلية السائل حامل قادرة على تبادل العازلة ، فمن الممكن لمتطلبات الفحص العامل المساعد لتكوين البروتين المعقدة. يمكن تشكيل الحمض النووي والبروتينات وفصلها في التجمعات القريبة من الوقت الحقيقي ، وحتى في الوقت الذي يجري تصويره. يمكن توليد الحمض النووي مع تسلسل محدد من الفائدة (على سبيل المثال عناصر الاستجابة الظني ، أو رواية تسلسل البروتين ملزمة) ، مختلطة مع بروتين الربط الافتراض ، وتصوير لتقديم أدلة مباشرة على التفاعلات بين الجزيئات. التنصت على وضع التصوير فؤاد هو الى حد كبير أقل تعقيدا إذا تستخدم العينات الجافة بدلا من العينات في المحاليل المائية ، وتقف على الحمض النووي DNA الخطية والبلازميدات دائرة مغلقة على حد سواء تم تصويره في هذا السبيل 3،9. الأسلوب المقدمة هنا تستخدم عينات مخزنة في الحلول من أجل توفير بيئة التصوير أكثر الفسيولوجية. وينبغي أيضا أساليب أخرى جديرة بالذكر من البروتينات التصوير النظر فيها ، بما في ذلك مجال الأشعة تحت الحمراء القريبة من المجهري 10. الاستخدام المتكامل للامتزاز مناعي في القرين مع فؤاد يوفر فرصة لإعداد مجموعة كبيرة من المجمعات البروتين ، وذلك باستخدام تقنيات راسخة البيوكيميائية ، وتصور لهم ثم بعد الإفراج عن بيليه الأجسام المضادة حبة immunoadsorbing. على سبيل المثال ، كان يعاير GR immunoadsorbed لارتباطه مع البروتين hsp70 كوصي الجزيئية (1) ، وكذلك البروتين السيارات داينين ​​2 باستخدام هذا النهج من أجل تقدير حجم التعقيد وstoichiometries. حجم الجسيمات وخصائص الفيزيائية الحيوية (مثل الصلابة) كانت مفيدة في التحقق من هوية الجزيئات الحيوية التي لوحظت في عينات من تصوير فؤاد 11،12. ومن الممكن أيضا لتأكيد الهوية جزيء حيوي عن طريق إضافة لجزيء حيوي التفاعل (مثل ليجند أو ريتوكسيماب) ، التي من شأنها ربط هدفها وتسبب زيادة حجم الجسيمات إذا كان الهدف هو جزيء حيوي الحالي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> البعد 3100 </td><td> بروكر </td><td> البعد 3100 </td></tr><tr><td> البعد السوائل الخليوي </td><td> بروكر </td><td> DTFML - DD - سعادة </td></tr><tr><td> رافعة حادة نيتريد (SNL) السيليكون نيتريد فؤاد التحقيق </td><td> بروكر </td><td> SNL - 10 </td></tr><tr><td> Microlever حادة رافعة نيتريد (MSNL) السيليكون نيتريد فؤاد التحقيق </td><td> بروكر </td><td> MSNL - 10 </td></tr><tr><td> NanoScope البرمجيات فؤاد الصك </td><td> بروكر </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> أقراص معدنية فؤاد العينة </td><td> تيد بيلا </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> الصف V1 أقراص ميكا ، 12 مم </td><td> تيد بيلا </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

قوة ذرية المجهر (فؤاد) يسمح للتصور الفردي للبروتينات ، جزيئات الحمض النووي ، ومجمعات البروتين البروتين ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. في نهاية ناتئ المجهر هو تحقيق نانو النطاق الذي يخترق المناطق صورة تتراوح بين نانومتر وميكرومتر ، وقياس الارتفاع من الجزيئات يستريح على سطح الركيزة في أي لحظة معينة. القوات الكهروستاتيكية تسبب البروتينات والدهون والأحماض النووية لإرفاق فضفاضة إلى الركيزة في التوجهات العشوائية والسماح التصوير. البيانات التي تم إنشاؤها تشبه الخريطة الطوبوغرافية ، حيث حل والجزيئات ثلاثية الأبعاد من أحجام الجسيمات منفصلة (الشكل 1) 1،2. التنصت وضع فؤاد ينطوي على التذبذب المتكرر للتعزية ، والذي يسمح التصوير من المواد الحيوية لينة نسبيا مثل الحمض النووي والبروتينات. واحدة من فوائد ملحوظة من فؤاد على غيرها من تقنيات النانو المجهري هو قدرتها على التكيف النسبي لتصور البروتينات الفردية والجزيئات في مجمعات المخازن المائية ، بما في ذلك شبه فيزيولوجي ظروف تخزينها مؤقتا ، في الوقت الحقيقي ، ودون تلوين أو طلاء العينة ليتم طباعتها. الطريقة المعروضة هنا يصف التصوير من الحمض النووي وعامل النسخ immunoadsorbed (أي مستقبلات جلايكورتيكود ، GR) مخزنة في محلول (الشكل 2). ويمكن فصل البروتينات والمجمعات Immunoadsorbed البروتين من بيليه الأجسام المضادة immunoadsorbing حبة من روح التنافس مع الأجسام المضادة وحاتمة ثم التقط (الشكل 2A). وهذا يسمح للتلاعب البيوكيميائية من الجزيئات الحيوية التي تهم قبل التصوير. المنقى مرة واحدة ، يمكن أن تكون مختلطة الحمض النووي والبروتينات ويمكن تصوير مجمع التفاعل الناتجة كذلك. الربط من الحمض النووي لالميكا يتطلب الموجبة ثنائي التكافؤ 3 ، مثل Ni 2 + 2 + أو Mg ، والتي يمكن أن تضاف إلى مخازن العينة بعد الحفاظ على نشاط البروتين. باستخدام نهج مماثل ، وقد استخدمت لتصوير فؤاد الانزيمات الفردية ، بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي (4) وانزيم تصليح 5 ، منضما إلى جدائل الحمض النووي الفردية. هذه التجارب تعطي تفسيرا واضحا في البروتين البروتين والحمض النووي والبروتينات البيوفيزيائية التفاعلات التي تحدث على المستوى الجزيئي. يمكن للجسيمات التصوير الجزيئات الفردية مع فؤاد مفيدا لتحديد الجسيمات التجانس ولتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات تصوير. بينما تم تطوير الطريقة الحالية لرؤية خيوط GR - البروتين والحمض النووي كوصي 1،2 المجمعات التي يمكن ربط الموارد الوراثية ، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع لعينات الحمض النووي والتصوير والبروتين من مصادر متنوعة.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

ووصف التنصت وضع مجهر القوة الذرية (AFM) طريقة لتصور DNA البلازميد ، بروتينات حشوية ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. الأسلوب يشمل النهج البديل لإعداد العينات للتصوير فؤاد التالية التلاعب البيوكيميائية. ويلاحظ والتي تحتوي على الحمض النووي محددة التفاعل البروتين المناطق العازلة في ظروف شبه فيزيولوجي.

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...