Name: visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья Грант GM086822. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Алек Пахомов и Пол Уоллес (Университет штата Вашингтон фонда Пользователь нанотехнологий (NTUF)) и Андреа Слейд (Bruker AXS) за их квалифицированную техническую помощь. АСМ изображения ДНК было проведено в Univ. Вашингтон NTUF, член Национальной сетевой инфраструктуры нанотехнологий. 2xGal4-2xGRE-luciferease плазмиды был любезно предоставлен лабораторией Доктор Кейт Ямамото (Университет Калифорнии, Сан-Франциско).

<ol>
	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

АСМ обеспечивает уникальные микроскопические техника способна изображений без покрытия отдельных биомолекул в водных и почти физиологическое буферных растворов в режиме реального времени. Это дает возможность визуализации отдельных белков и молекул ДНК, а также multiprotein комплексов и белок-ДНК комплексах. Изображений макромолекулярные частицы с AFM могут быть полезны для оценки однородности образца и для выявления физическое расположение составляющих компонентов наблюдаемых частиц. Такой подход наблюдения отдельных частиц макромолекулярных может быть полезным дополнением к обычным биохимические методы, такие как иммунопреципитации анализов, электрофорез в полиакриламидном геле и гель-хроматографии на колонке, которые обеспечивают значительные итоговые данные, представляющие 10 3 -10 11 отдельных комплексов биомолекулярных интереса настоящее в образце. Исследование multiprotein комплекс стехиометрии, биомолекулярных взаимодействий и кофактор требования могут быть исследованы с помощью АСМ. Метод, изложенный здесь, может быть модифицированы с учетом конкретных биофизических интересующие вопросы. Например, при использовании жидкого держатель зонда ячейки способны обмениваться буфера, это возможность анализа кофактора требования к образованию белкового комплекса. ДНК-белковых сборки могут быть сформированы и диссоциированных в близком к реальному времени, и даже находясь в образ. ДНК может быть создан с конкретной последовательности интерес (например, элементы предполагаемого ответа или роман связывания с белками последовательности), смешанного с предположили связывающий белок, и отображаемого предоставить прямые доказательства межмолекулярных взаимодействий. Нажатие режиме АСМ изображений значительно менее сложным, если сухие образцы используются образцы, а не в водных растворах, и линейные стоит ДНК и закрытого круга плазмид ДНК оба были отображаемого таким образом 3,9. Метод, представленный здесь используются образцы в буферных растворах с целью обеспечения более физиологических визуализации окружающей среды. Другие примечательные методы визуализации белков Следует также учитывать, в том числе ближнего поля инфракрасной микроскопии 10. Комплементарного использования иммуноадсорбции в супруги с АСМ обеспечивает возможность подготовить множество белковых комплексов, с использованием устоявшихся биохимических методов, а затем визуализировать их после освобождения из immunoadsorbing антитело-бусинка гранул. Например, immunoadsorbed ОТО анализировали на его связь с молекулярными белка hsp70 шаперона 1, а также белка динеин двигателя 2, используя этот подход, чтобы оценить размер и сложный стехиометрии. Размер частиц и биофизических особенностей (например, жесткости) были полезны в установлении личности биомолекул наблюдается в АСМ отображаемого образцы 11,12. Возможно также, чтобы подтвердить биомолекулы идентичности путем добавления взаимодействующего биомолекулы (например, лиганд или моноклональные антитела), которые связываются с его целью и причиной увеличения размера частиц, если цель биомолекулы присутствует.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Измерения 3100 </td><td> Bruker </td><td> Измерения 3100 </td></tr><tr><td> Сотовые измерения жидкости </td><td> Bruker </td><td> DTFML-ДД-HE </td></tr><tr><td> Sharp рычаг нитрида (SNL) нитрида кремния АСМ-зондом </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever резкое нитрида рычаг (MSNL) нитрида кремния АСМ-зондом </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> Наноскоп АСМ программный инструмент </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Металл диски АСМ образца </td><td> Тед Пелла </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Класс В1 Слюда диски, 12 мм </td><td> Тед Пелла </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет визуализировать отдельных белков, молекулы ДНК, белок-белковых комплексов, и ДНК-белковых комплексов. На конце кантилевера микроскопа является нано-зонда, который пересекает участки изображения от нанометров до микрометров, измерения высоты макромолекул отдыхая на поверхности подложки в любой заданной точке. Электростатические силы вызывают белки, липиды и нуклеиновые кислоты, чтобы свободно прикрепляться к субстрату в случайной ориентации и разрешения изображений. Сгенерированные данные напоминают топографические карты, где макромолекул решения в виде трехмерных частиц дискретных размеров (рис. 1) 1,2. Нажатие режиме АСМ включает в себя повторяющиеся колебания кантилевера, который позволяет изображения относительно мягких биоматериалы, такие как ДНК и белки. Одним из значительных преимуществ по сравнению с другими АСМ наноразмерных микроскопии является его относительная приспособленность к визуализации отдельных белков и макромолекулярных комплексов в водных буферов, в том числе почти физиологическим буфером условиях, в режиме реального времени, и без окрашивания или покрытия образца для включения в образ. Метод, представленный здесь описывает изображения ДНК и immunoadsorbed фактор транскрипции (то есть глюкокортикоидных рецепторов, GR) в буферном растворе (рис. 2). Immunoadsorbed белков и белковых комплексов может быть отделено от immunoadsorbing антитело-шарик шарик-за конкуренции с эпитопом антитела, а затем в образ (рис. 2а). Это позволяет для биохимических манипуляций биомолекул интереса до визуализации. Как только очищенную, ДНК и белки могут быть смешанными, и результирующая комплекс взаимодействующих могут быть отображены также. Связывание ДНК слюды требует двухвалентных катионов 3, таких как Ni 2 + или Mg 2 +, которые могут быть добавлены в образце буфера при этом поддерживать белок деятельности. Используя аналогичный подход, АСМ была использована для визуализации отдельных ферментов, в том числе РНК-полимеразы 4 и ремонт фермента 5, связанные с отдельными нитей ДНК. Эти опыты значительно углубить понимание белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий биофизических происходит на молекулярном уровне. Изображения отдельных частиц макромолекулярных с AFM могут быть полезны для определения однородности частиц и для выявления физическое расположение составляющих компонентов из отображаемого частиц. Хотя настоящий метод был разработан для визуализации GR-шаперонов белковые комплексы 1,2 и ДНК которых GR может связать, он может быть применен в широком смысле ДНК и белка изображений образцов из различных источников.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Нажав режиме атомно-силовой микроскоп (АСМ) метод визуализации ДНК плазмиды, цитоплазматические белки и ДНК-белковых комплексов описан. Метод включает в себя альтернативные подходы для подготовки образцов для АСМ-изображений следующих биохимических манипуляций. ДНК, содержащей конкретных регионах взаимодействующих белков наблюдаются в ближнем физиологических условиях буфера.

Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...