Name: igy technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (peg) precipitation
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00
Duration: 7 min 26 s
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这项工作是由德国联邦教育与研究部的赠款支持（项目BiGRUDI [毕ologische摹efahrenlagen：R isikobewertung，ü ltraschnelle ð etektion 和我dentifizierung冯bioterroristisch relevanten Agenzien，13N9594]） 。我们感谢B. Diemar（Charité Universitätsmedizin柏林，研究所献给Pharmakologie）优秀的技术援助。

1。通过PEG沉淀提取协议 - 卵黄图1给出了一个IgY的提取过程示意图（见表2）。该协议最初是在波尔森等 。 1980年。 使用乳胶手套，应执行的所有步骤。 <ol><li>仔细蛋壳破裂，蛋黄转移到一个“蛋黄勺”，以尽可能多的蛋白尽可能删除。 </li><li>蛋黄是转移到滤纸和冷轧删除余下的蛋清，蛋黄皮肤被切断与柳叶刀或类似工具（枪头）。倒入50毫升管蛋黄和蛋量（V1），注册。 </li><li>两次蛋黄体积的PBS混合蛋黄（ΣV1+ V2），其后为3.5％PEG 6000总量（克，煤粉）和振荡，其次是在一个滚动的混频器滚动10分钟。这一步分离提取过程分两个阶段进行停牌。一个阶段，包括“蛋黄固体和脂肪类物质”（原报价波尔森等人，1980年）和水样含有卵黄抗体和其他蛋白质的阶段。 </li><li>离心管是在4 ° C为20分钟（每分钟10000转13000 XG，贺利氏Multifuge 3SR +固定角度转子）。上清（V3）浇通过折叠滤芯，并转移到一个新的管。 </li><li>添加8.5％聚乙二醇6000克（根据新卷）管，振荡并在第3步中的滚动搅拌机推出。 </li><li>重复第4步的差异，被丢弃上清。 </li><li>仔细颗粒溶解在1 mL PBS玻璃棍和vortexer。 PBS是一个10毫升的最终卷（V4）。解决的办法是混有12％的PEG 6000（W / V，1.2克），并在第3步（旋涡，滚动混频器）治疗。 </li><li>重复步骤6和800μLPBS溶解沉淀仔细（玻璃粘和涡）。等待气泡消失，然后转移（​​吸管）洗肾胶囊提取。 400μLPBS冲洗管和添加量的透析设备（V5）。 （见透析设备和膜的制备附录。） </li><li>提取物是夜间透析超过0.1％的盐水（1600毫升），通过磁力搅拌器轻轻搅拌。第二天早晨，用PBS代替生理盐水，再过三个小时的透析。 </li><li>此后IgY的提取物是从透析胶囊拉吸管，并转移至2ml管。最终体积约2毫升（V6发动机）。 </li><li>光度测量的样品的蛋白质含量（毫克/毫升）是在280 nm（用PBS稀释1:50），根据朗伯 - 比尔定律计算为IgY的消光系数为1.33（见图2），图。 4显示了该制剂的质量（纯度和回收率都在80％左右）。 </li><li>这是最好存储在样品分装于-20℃（不冻结的样品在-70 ° C）。 </li><li>在朱庇特的协议描述<a href="http:/www.jove.com/details.php?id=1916">http:/www.jove.com/details.php?id=1916</a>的最后准备工作的质量是由简单的SDS - PAGE分析</li></ol> 2。附录使用前透析袋，必须根据制造商的建议，准备以下列方式： <ol><li> 20透析袋切割件30厘米，在一个2000毫升的玻璃烧杯。 </li><li> 1750毫升5毫米EDTA解。 </li><li>一个玻璃漏斗放在袋以上，以确保袋是由EDTA溶液。解决的方法是加热煮沸5分钟（热板）。解决的办法是转自袋是用蒸馏水洗涤三次。 </li><li>再次1,750毫升EDTA的解决方案，补充说，煮沸5 min，用蒸馏水洗涤三次以上。 </li><li>最后，透析袋煮沸蒸馏水10分钟，并保存在4 ° C。消毒镊子取出透析袋。 </li></ol> 3。代表性的成果<img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。卵黄提取的示意图，根据聚乙二醇沉淀波尔森等人的原始描述。 1980年， <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">要查看一个较大的图像，请点击这里</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="图2" /> 图2的年龄依赖性的免疫母鸡的鸡蛋蛋黄中总IgY的发展。是每周平均总IgY的/蛋和SD（N = 4蛋鸡）。从[Pauly 等人，2009年]）。 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="图3" /> 图3。拉依吴四只蛋鸡，不同的抗原免疫能力监测。箭头指示免疫日期（从[Pauly 等人，2009年]）。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">查看大图请点击这里。</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="图4" /> 图4。还原条件下个人IgY的准备工作，从不同的鸡蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳 巷1 - 2巷 - IgY的标准，巷3-5 - 不同IgY的样品分子量标记，准备在协议中所述。这些最后的准备，根据该协议的步骤10。慧聪 - 重链，液相色谱 - 光chaines，？ -相应的分子量约35 kDa的（可能卵黄二，易制毒化学的C -末端片段，[Klimentzou等，2006]）的细微杂质。 <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td> 鸡21（抗原A） </td><td> 鸡22（抗原A） </td><td> 鸡19（抗原乙） </td><td> 鸡23（抗原彗星） </td></tr><tr><td>产蛋数（总IGY）1，2年期</td><td> 625（38克） </td><td> 626（38克） </td><td> 545（33克） </td><td> 608（37克） </td></tr><tr><td>产蛋数（总IgY的），第一年</td><td> 345（20克） </td><td> 304（16克） </td><td> 326（18克） </td><td> 308（17日克） </td></tr><tr><td>产蛋数（总IgY的），第二年</td><td> 280（18克） </td><td> 322（21克） </td><td> 219（15克） </td><td> 300（20克） </td></tr><tr><td> ％最大。可能产蛋数（第一年）2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> ％最大。可能产蛋数（第二年） </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td>加工蛋</td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 IgY的总额是60毫克每鸡蛋的蛋白质，根据图2中的数据的平均值乘以一个鸡蛋的数量计算。 2最大。根据饲养员的信息可能每年产蛋数为325。 表1。两年的统计数据具有不同的抗原免疫鸡的产蛋能力。铺设与不同的抗原，以及在两年IgY的结局后的免疫能力，最多四只蛋鸡％（参见图3）， 保利等人，2009年] ）。 <table border="1"><tbody><tr><td> 蛋NR。 </td><td> 母鸡NR。布设日期 </td><td> V1 [ML]蛋黄 </td><td> V2 [ML] PBS </td><td> 1。聚乙二醇PREC。 [G] </td><td> VOL [ML]后 </td><td> 2。聚乙二醇PREC。 [G] </td><td> 弹丸 </td><td> 3。聚乙二醇PREC。 [G] </td><td> 弹丸 </td><td> VOL [毫升] </td><td> 总蛋白毫克/毫升 </td><td> 矫正总蛋白毫克/毫升 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1ΣV1+ V2 </td><td> 3.5％W / V]ΣV1+ V2 </td><td> PREC。centrif。和过滤的V3 </td><td> 8,5％[W / V] V3 </td><td>溶解于毫升PBS V4 </td><td> 12％[W / V] V4 </td><td>溶于毫升PBS V5 </td><td>经过透析对PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml：1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10。 </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10。 </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> 表2 PEG沉淀模范协议。

<ol>
	<li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain.">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li><li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins:+a+review.">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li><li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h., Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly,+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li><li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+laying+capacity,+immunoglobulin+Y+concentration,+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period.">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li><li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens.">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li><li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , (2001).</li><li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li><li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies.">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li></ol>

动物实验Landesamt毛皮Gesundheit和Soziales柏林（H 0069/03）所规定的准则和法规的规定执行。

选择一个合适的IgY的提纯方法是影响净化（实验室或工业），成本效益，技术（实验室设备），和对环境的影响（废物管理）的规模。德Meulenaer Huyghebaert（2001年，审查也看到SCHADE 等 ，2005）详细审查各种IgY的提取方法。在一般情况下，这些方法可分为三个主要群体： <ol><li> 沉淀法：涉及铵或硫酸钠，聚乙二醇（PEG），辛酸和caragenean。 </li><li> 色谱方法：thiophylic相互作用层析，疏水层析，亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤色谱。 </li><li> 超滤 。 </li></ol> IgY的制备纯度可提高相结合的方法，例如，PEG沉淀可与亲和层析结合。在某些情况下，取决于最终的应用程序，IgY的水提取物足以达到良好的效果（秋田县井1993年）。根据我们的经验，IgY的样本，我们获得PEG沉淀在很多不同的免疫检测工作非常出色。通过规范的PEG沉淀法，一个技术助理是能够处理约84鸡蛋每星期，这相当于4至7克，每周的总卵黄金额。一个简单的计算：一个蛋鸡是一种抗原免疫接种。经过几次提高免疫接种母鸡的生产与1:50,000滴度的特异性抗体（AB）在为期30天。 30鸡蛋× 2毫升卵黄提取物（见协议和图3），相当于总卵黄60毫升，这反过来又对应AB - 3000升的稀释（一斗的容量为10升），这意味着有3000升AB的解决方案，300桶，可填补。因此，在数量如此巨大的AB -的存储稳定的质量和特异性抗体池，它是没有问题的。这种技术减少了充电/很多的可变性，否则在多特异性抗体观察。 尽管数量方面，卵黄抗体与哺乳动物IgG抗体相比有更多的优势：没有激活哺乳动物补体系统，没有交叉反应HAMA（人抗鼠抗体），类风湿因子或人类的血型抗原（heteroagglutinins缺乏）。 卵黄抗体的一个突出的优点是所谓的进化距离。亲缘距离是经常描述的哺乳动物和鸡的抗体特异性之间差异的原因，即使在相同的免疫。除了哺乳动物和禽流感的免疫系统本身之间的差异，在进化发展的差异，这两个动物类AB不同的特殊性。几位作者报道，鸡往往会产生ABS对系统发育上高度保守的哺乳动物蛋白或多肽更有效地比兔（审查SCHADE等A. 2005）。因此，可以保持一个保守的抗原“蒙面”兔的免疫系统，从而导致只有微弱或“沉默”回应。此外，如果鸡兔是哺乳动物具有相​​同的抗原免疫的，往往是鸡与AB -特异性，很少能在兔子取得回应。动物福利方面是重要的，因为是AB从蛋黄中提取的非侵入性。结合基因枪（质粒）免疫IgY的生产是完全非侵入（Witkowski 等 2009）。 总之，母鸡和PEG沉淀IgY的提取生产的AB是非常符合成本效益和高度特异性的与稳定的滴度AB以1:1,000,000结果。由于鸟类和哺乳动物之间的进化距离，鸡能够产生对特定的高度保守的哺乳动物抗原抗体，如兔。 IgY的技术获得数额特别巨大的AB，打开门也使用在人类医学和兽医学卵黄抗体治疗/预防的目的。

<ol><li>透析袋Visking，27/32型，切断-14 KD，卡尔罗斯公司，德国卡尔斯鲁厄</li><li>猎鹰管蓝最大，50毫升聚丙烯锥形管，碧迪医学实验，富兰克林湖，美国纽约</li><li>折叠滤芯百万615 ¼，∅150毫米，卡尔罗斯公司，卡尔斯鲁厄，德国Heraeus </li><li>磁力搅拌器，Variomag单声道，H + P实验室技术股份公司，Oberschleißheim，德国</li><li>微透析胶囊5,0毫升，卡尔罗斯公司，德国卡尔斯鲁厄</li><li> Multifuge 3SR +，Thermo Scientific的Langenselbold，德国</li><li>光度计UV - 160A，日本岛津德国公司，德国杜伊斯堡</li><li>聚乙二醇6000，Rotipuran药典，卡尔罗斯公司，德国卡尔斯鲁厄</li><li>预混PBS缓冲10X，罗氏诊断有限公司，德国曼海姆</li><li>滚筒搅拌机SRT2，司徒，英国斯塔福德郡， </li><li> Vibrofix VF2，Janke Kunkel，德国IKA，实验室技术，德国，诗道芬i.Br. </li><li>蛋黄勺，Fackelmann（houshold效果），德国</li></ol>

igy technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (peg) precipitation

母鸡可以通过IM疫苗接种（ 胸肌 ，左，右，注射量为0.5-1.0毫升）的手段，或通过质粒基因枪免疫接种。依赖于抗原的免疫原性，高的抗体滴度（高达1:100000 - 1:1,000,000）可以达到后，只有一个或3 - 4提高免疫接种。通常，一只母鸡下蛋持续约72周，随后铺设能力下降。这个协议描述手段（PEG.波尔森等人 ，1980年）的降水过程，从蛋黄中总IgY的提取。该方法包括两个重要的步骤。第一个是清除血脂，第二个是从第一个步骤上清总IgY的降水。反对的缓冲液（通常PBS）透析后的IgY的提取物可以储存在-20 ° C了一年多。提取的纯度在80％左右，每个鸡蛋的总IgY的不同从40-80毫克，依赖于蛋鸡年龄。总IgY的母鸡的年龄大约为40毫克/蛋高达80毫克/蛋（关于PEG沉淀）含量的增加。铺设了母鸡每年的容量大约为325鸡蛋。这意味着潜在总收成的20克总卵黄/年的平均卵黄含量60毫克的总IgY的/蛋（见表1）的基础上。

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IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

这个协议描述，尤其是从蛋黄IgY的提取由聚乙二醇沉淀的手段，并给出了有关IgY的技术信息。

IgY的技术：从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇（PEG）降水量

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Research

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