Name: detection of histone modifications in plant leaves
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00
Duration: 7 min 8 s
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<p class="jove_content">这项工作是由德国科学基金会（DFG）和德国联邦政府和各州政府的卓越倡议。 </p>

<p class="jove_title"> 1。植物材料的交联</p><ol><li>收获1 - 2G的拟南芥叶（6到10cm莲座直径）在50毫升的塑料管，填补了交联的缓冲区，以40ML。 </li><li>确保叶留沉浸例如，通过量身定制的过滤海绵权馅上述缓冲表面。然后放置在干燥器管。 </li><li>真空渗透为10分钟。每管加入2.5毫升2M甘氨酸停止交联，并反转管，以保证平等的甘氨酸分散。 </li><li>真空渗透另一个5分钟，并丢弃液体，同时收获叶筛子。 </li><li>洗叶两次1L水在玻璃烧杯中，然后用纸巾彻底干叶。 </li><li>收集在一个新的塑料管的叶子和液氮冻结。商店叶在-80 ° C直到染色质隔离。 </li></ol><p class="jove_title"> 2。染色质隔离</p><ol><li>叶地面砂浆和雌蕊，在液氮中保存，直到使用。 </li><li>转让粉，50毫升的塑料管，并暂停在30ml提取缓冲液＃1。 </li><li>在4 ° C孵育15分钟上的开销摇床。 </li><li>滤液暂停通过四层的miracloth到一个新的50毫升的塑料管。 </li><li>在2800 XG 20分钟旋转4 ° C。 </li><li>去除上清液，并中止与油漆刷在1​​ML提取缓冲液＃2沉淀。首先添加一个缓冲区＃2，体积小，然后用画笔暂停颗粒，然后添加其余的缓冲区。 </li><li>转移悬浮在12000 XG到1.5ml离心管和旋转为10分钟，4 ° C。 </li><li>同时，准备液2ml离心管1.5ml的提取缓冲液＃3。 </li><li>从纺管（步骤2.7）去除上清液，并暂停在提取缓冲液＃3300μL沉淀。首先添加一个缓冲区＃3，体积小，暂停与画笔颗粒，然后添加剩余的缓冲区。 </li><li>仔细吸管的悬浮颗粒（步骤2.9）1.5 mL提取缓冲液中，在步骤2.8准备＃3顶部。确保两个阶段不会混合。上半年的16,000 XG旋转4 ° C。 </li><li>去除上清液，并中止与染色质颗粒在超声缓冲液300μL的油漆刷。 </li><li>超声sonotrode，或在超声波浴染色，一个约400bp的DNA大小。当超声，确保染色不会被加热以上约30 ° C保护热敏感的交联。需要通过实验确定，因为它变化显著不同超声设备的超声时间。为指导，提供两个不同的设备设置： </li></ol><p class="jove_content">对于超声一个Bandelin品牌sonotrode暴露在0.6mL离心管中染色质的5倍至20连发设置25％的电力，周期= 50。虽然这样做，在冰浴后，每20 <sup>次</sup>阵阵清凉样品。 </p><p class="jove_content">超声与Diagenode Bioruptor超声波浴，填补水和冰的浴缸和超声设置“高”的30秒在1.5ml的离心管的10倍。每隔30秒后，再过30秒冷却样品。 </p><ol start="13"><li>旋转超声16,000克的样品为5min，4 ° C至沉淀不溶物质。上清可直接用于免疫。另外，样品可在液氮中冷冻，并保存于-80℃直至进一步的冲击。 </li></ol><p class="jove_title"> 3。免疫沉淀</p><ol><li>准备2 ml离心管40μL蛋白 - 琼脂糖和抗体结合缓冲液1.8mL。染色准备加入200μL（步长2.13）。 </li><li>开销摇床孵育1h后管。 </li><li>放弃蛋白A琼脂糖珠和使用免疫上清。 </li><li>删除一个40μL等分，以确定染色质浓度（“输入”）。 </li><li>加入30μL蛋白一琼脂糖和修改特异性抗体，是在特定的试剂和仪器400μL超声染色质悬浮如下表所示金额。 </li><li> 2.5H或架空摇床过夜孵育4 ° C。 </li><li>自旋为2分钟，在440 × G.珠</li><li>洗珠颗粒，每个洗涤缓冲液900μL（见以下列表）。对于每一个缓冲区，然后在10分钟的缓冲开销摇床4℃，孵化珠为2分钟旋转440 XG，弃上清液，并添加下一个缓冲区。 <ol><li>低盐缓冲液洗</li><li>高盐缓冲液洗</li><li>氯化锂洗涤缓冲液</li><li> TE缓冲液洗</li></ol></li><li>最后一次洗涤后，彻底清除任何剩余的缓冲区。 </li></ol><p class="jove_title"> 4。组蛋白和DNA的交联和沉淀DNA纯化</p><ol><li>将去交联缓冲区100μL琼脂糖颗粒和步骤3.4样品40μl的“输入”，在旋涡混合器混合5min后，旋转样品，并培育贝特在65 ° C过夜。 </li><li>商业的DNA或PCR纯化试剂盒纯化的DNA。 </li><li>通常情况下1:5稀释的最后一列洗脱液5μL足以执行特定常规轨迹实时定量RT - PCR（RT - qPCR的）。 </li></ol><p class="jove_title"> 5。缓冲区表</p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>交联的缓冲区</strong> </td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td> 10MM </td></tr><tr><td>蔗糖</td><td> 400MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β-巯基乙醇</td><td> 5MM </td></tr><tr><td>甲醛</td><td> 3％（V / V） </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>提取缓冲液＃1</strong> </td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td> 10MM </td></tr><tr><td>蔗糖</td><td> 400MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β-巯基乙醇</td><td> 5MM </td></tr><tr><td>完整的蛋白酶抑制剂</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>提取缓冲液＃2</strong> </td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td> 10MM </td></tr><tr><td>蔗糖</td><td> 250MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β-巯基乙醇</td><td> 5MM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2的</sub> </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> TRITON X - 100 </td><td> 1％（W / V） </td></tr><tr><td>完整的蛋白酶抑制剂</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>提取缓冲液＃3</strong> </td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td> 10MM </td></tr><tr><td>蔗糖</td><td> 1.7M </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β-巯基乙醇</td><td> 5MM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2的</sub> </td><td> 2MM </td></tr><tr><td> TRITON X - 100 </td><td> 0.15％（W / V） </td></tr><tr><td>完整的蛋白酶抑制剂</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>超声缓冲</strong> </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 25MM </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 5MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5％（W / V） </td></tr><tr><td>完整的蛋白酶抑制剂</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>抗体结合缓冲液</strong> </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 50MM </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 1MM </td></tr><tr><td>氯化钠</td><td> 150MM </td></tr><tr><td> TRITON X - 100 </td><td> 0.1％（W / V） </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>低盐缓冲液洗</strong> </td></tr><tr><td>氯化钠</td><td> 150MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1％（W / V） </td></tr><tr><td> TRITON X - 100 </td><td> 1％（W / V） </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 2MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>高盐缓冲液洗</strong> </td></tr><tr><td>氯化钠</td><td> 500MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1％（W / V） </td></tr><tr><td> TRITON X - 100 </td><td> 1％（W / V） </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 2MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>氯化锂洗涤缓冲</strong>液</td></tr><tr><td>氯化锂</td><td> 250MM </td></tr><tr><td> Nonidet - P40 </td><td> 1％（V / V） </td></tr><tr><td>钠去氧胆</td><td> 1％（W / V） </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 1MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE缓冲液洗</strong> </td></tr><tr><td> EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值8.0 </td><td> 1MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking缓冲区</strong> </td></tr><tr><td>的Tris - HCl，pH值6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td>氯化钠</td><td> 200MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2％（W ​​/ V） </td></tr><tr><td>数码地面电视</td><td> 10MM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6。代表性的成果： </p><p class="jove_content"> <em>拟南芥PR2</em>防御基因的表达，编码β -1,3 -葡聚糖酶，抗菌<sup>活性</sup> 12，苯并噻二唑（BTH）诱导，人工合成的植物<sup>激素</sup>水杨酸<strong>3模拟</strong>图1表明<em>，激活</em> PR2的表达与组蛋白乙酰化赖氨酸残基上增加相关。 H3和H4 <em>PR2的</em>发起人。由于核小体密度降低在基因的激活<sup>13，</sup>组蛋白乙酰化值正常化不变区域的组蛋白3抗体获得的信号。 </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="图1"/><br /> <strong>图1 BTH诱导<em>PR2的</em>发起人在拟南芥组蛋白乙酰化</strong> 。植物均采用100μm的BTH或可湿性粉剂控制。 72h后，叶收集和染色质隔离。乙酰特异性抗体（如图所示）沉淀后得到的信号是标准化，以获得一种抗体降水不变域的组蛋白H3的信号。沉淀染色质，定量RT - qPCR的。数据是在BTH处理的情况下组蛋白修饰水平的标准化。 </p>

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<p class="jove_content">没有利益冲突的声明。 </p>

<p class="jove_content">在协议中最重要的步骤是DNA和组蛋白，叶片材料的类型和数量的交联，研磨材料，染色质的超声。对于这些问题的更详细的讨论，请参阅参考文献。 9日和10日。 </p><p class="jove_step">超声和​​交联： </p><p class="jove_content">重要的是要破坏约400bp的片段，在超声染色。力竭超声破坏，破坏DNA和组蛋白的染色质，而超声不足会留下长期的染色质片段。这些影响的方法的特异性，因为从远端测试位点的组蛋白修饰，不能从本地修改歧视。超声效率是最好的测试，通过收集样品20μL前后超声，交联DNA和组蛋白，染色质隔离的DNA，并确定剪切DNA的琼脂糖凝胶电泳长度。应增加核糖核酸酶电泳前样品，染色质的准备，因为仍含有大量的RNA，在这个阶段净化零散的DNA的可视化，可能会干扰。样品是有用的染色质免疫沉淀，如果从非剪切染色质DNA大于10kbp，而从剪切染色质DNA形式的DNA大约400bp的最大信号强度一抹黑。 </p><p class="jove_content">我们经常使用完整的叶片的染色质交联3％（V / V）的甲醛，但在大多数情况下有足够的1％（V / V）的甲醛可能。在我们的手中，低甲醛浓度允许超声时间较短和随之而来的PCR反应的背景信号。然而，甲醛不足，往往会造成PCR检测信号之间的独立实验重复性低。这可能是由于不足的渗透与甲醛在低浓度的叶。确保经常交换甲醛股票的复合趋于聚合，随着时间的推移。甲醛溶液是稳定的，只有约一个月，而这个时期是难以长期甲醇稳定。这是建议设立实验条件时，以测试不同的甲醛浓度。 </p><p class="jove_step">植物材料和磨削的金额： </p><p class="jove_content">重要的是要在大量的缓冲渗透叶片材料的低量，以避免彼此的树叶粘。叶坚持结果往往不足的甲醛渗透。此外，过多的植物材料将阻塞毛孔的miracloth组织。研磨效率大大取决于使用迫击炮和杵完美契合。我们经常磨，用液氮冷却的杵和砂浆在没有额外的液态氮50秒，直到材料磨成细粉。 </p>

<table border="1"><tbody><tr><th>试剂名称</th><th>公司</th><th>目录编号</th><th>评论</th></tr><tr><td>蛋白A -琼脂糖</td><td>罗氏公司</td><td> 11 134 515 001 </td><td>取决于抗体类</td></tr><tr><td>蛋白 - G -琼脂糖</td><td>罗氏公司</td><td> 11 243 233 001 </td><td>取决于抗体类</td></tr><tr><td>反hyperacetyl - H4 </td><td> Millipore公司</td><td> 06-946 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰H4K5 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-327 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰H4K8 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-328 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰- H4K12 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-595 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰- H4K16 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-329 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰- H4K18 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-354 </td><td>我们使用1μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰H3K9 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-352 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-乙酰- H3K14 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-353 </td><td>我们使用1μL </td></tr><tr><td>反H3K4三甲基- </td><td> Diagenode </td><td> PAB - 003 - 50 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-二甲基- H3K4 </td><td> Millipore公司</td><td> 07-030 </td><td>我们用5μL </td></tr><tr><td>抗-甲基- H3K4 </td><td> Abcam公司</td><td> ab8895 </td><td> 2,5 - 10μL </td></tr><tr><td>反H3 </td><td> Abcam公司</td><td> ab1791 </td><td>我们使用1μL检查组蛋白密度</td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD - 200到</td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td>完整的蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏公司</td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of histone modifications in plant leaves

<p class="jove_content">在真核生物中基因表达的调控，染色质结构是很重要的。在这个过程中，染色质重塑，DNA甲基化和共价修饰组蛋白H3和H4的氨基末端尾巴，发挥重要<sup>作用</sup> 1-2 。 H3和H4组蛋白修饰包括赖氨酸和精氨酸甲基化，乙酰赖氨酸和丝氨酸残<sup>基</sup> 1-2的磷酸化。这些修改相关的基因的激活，镇压，或支持适当的信号（微生物相关分子模式，光，激素等<sup>）3-7</sup>知觉后，更迅速和更强大的表达激活的基因，致敏状态。 </p><p class="jove_content">在这里，我们提出了一个具体选定的植物基因的染色质修饰可靠，灵敏的检测方法。该技术是基于（修改），组蛋白与甲醛<sup>8,9，</sup>提取和修改特定抗体<sup>9,10</sup>超声染色，染色质免疫沉淀（ChIP）DNA的交联，组蛋白- DNA复合物的交联，特定基因实时定量PCR。该方法已被证明可用于检测与C <sub>4</sub>光合作用玉米<sup>5,11</sup>和<sup>3</sup>在拟南芥中的全身免疫相关的特定组蛋白修饰。 </p>

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Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">一个可靠的和有用的方法来检测特定的植物基因组蛋白修饰的描述。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和实时定量PCR。它允许在不同的生理过程作用，对特定的基因组蛋白修饰的检测。</p>

检测组蛋白修饰在植物叶片

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