Name: detection of histone modifications in plant leaves
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Histone Modifications in Plant Leaves at JoVE.com

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע הגרמנית (DFG) ויוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית. </p>

<p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. Crosslinking של חומר צמחי </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 1-2G עלים ארבידופסיס (6 לקוטר שושנת 10 ס&quot;מ) בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל פלסטיק למלא עד 40mL עם חיץ crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא עלים להישאר שקוע, למשל על ידי מלית זכות המותאמים ספוג לסנן מעל פני השטח חיץ. אז במקום צינורות ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 10min. כדי להוסיף צינור כל 2.5mL של גליצין 2M להפסיק crosslinking, וכן להפוך צינורות כדי להצדיק פיזור שווה של גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 5min נוסף וזורקים נוזל תוך קצירת העלים על מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם העלים 1 ליטר של מים בכוס זכוכית, אז העלים היבשים ביסודיות בעזרת מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העלים בצינור פלסטיק טריים להקפיא בחנקן נוזלי. חנות יוצאת בשעה -80 ° C עד הבידוד הכרומטין. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2. בידוד של הכרומטין </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלים היו הקרקע עם מרגמה פיסטיל כי הוחזקו חנקן נוזלי עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת אבקת שפופרת 50 מ&quot;ל פלסטיק להשעות במאגר מיצוי 30 מ&quot;ל # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 15min ב 4 ° C על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין ההשעיה דרך ארבע שכבות של miracloth לתוך צינור 50 מ&quot;ל טרי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין עבור 20min XG ב 2800 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות גלולה עם מברשת צבע במאגר מיצוי 1mL # 2. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 2, אז להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את שאר חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה לצינור microfuge ספין 1.5mL עבור 10min ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין 2ml-microfuge צינורות המכיל מאגר מיצוי 1.5mL # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מהצינור סובב (שלב 2.7) ו להשעות גלולה ב 300μL של חיץ מיצוי # 3. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 3, להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את המאגר הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות pipet מושעה גלולה (שלב 2.9) על גבי החיץ 1.5 מ&quot;ל מיצוי # 3 מוכן בשלב 2.8. ודא כי שני השלבים לא לערבב. ספין עבור 1h ב XG 16,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות הכרומטין גלולה עם מברשת צבע 300μL של חיץ sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הכרומטין עם sonotrode, או באמבטיה קולי, לגודל ה-DNA של 400bp כ. כאשר sonicating, לעשות הכרומטין בטוח לא יהיה מחומם מעל כ -30 ° C כדי להגן רגישים לחום crosslinks. משך sonication צריך להיקבע באופן ניסיוני, כי זה משתנה באופן משמעותי בין התקנים sonication שונים. לקבלת הדרכה, ההגדרות עבור שני מכשירים שונים ניתנים: </li></ol><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור sonication עם sonotrode המותג Bandelin לחשוף הכרומטין בצינור microfuge 0.6mL חמש פעמים עד 20 התפרצויות עם הגדרות 25%, מחזור כוח = 50. תוך כדי כך, מדגם מגניב אחרי כל 20 התפרצויות <sup>ה</sup> באמבט קרח. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור sonication עם אמבטיה Diagenode Bioruptor קולי, למלא אמבטיה עם מים וקרח sonicate עשר פעמים במשך 30 שניות בתוך צינורות microfuge 1.5mL עם ההגדרה &quot;גבוה&quot;. אחרי כל 30 שניות, דגימות מגניב עוד 30 שניות. </p><ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין sonicated מדגם עבור 5min ב g 16,000 ב 4 ° C כדי לזרז חומר שלא נמס. Supernatant יכול ישירות לשמש immunoprecipitation. לחלופין, ניתן דגימות הלם קפוא בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3. Immunoprecipitation </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2-mL צינורות microfuge המכיל חלבון 40μL agarose ו 1.8mL של חיץ נוגדן מחייב. הוסף 200μL של הכנת הכרומטין (שלב 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות עבור 1h על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חלבון חרוזים agarose ולהשתמש supernatant עבור immunoprecipitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 40μL-aliquot כדי לקבוע ריכוז הכרומטין (&quot;קלט&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30μL חלבון agarose ואת כמות הנוגדנים שינוי ספציפי זה המצוין בטבלה שלהלן של ריאגנטים ספציפיים וציוד ההשעיה 400μL הכרומטין sonicated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 2.5h או לילה על שייקר תקורה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים עבור 2min ב 440 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוז גלולה 900μL של חיץ כל לשטוף (ראה רשימה להלן). במשך כל חיץ, חרוזים דגירה במאגר עבור 10min על שייקר ממעל על 4 מעלות צלזיוס, אז בשביל ספין 2min ב XG 440, להשליך supernatant, ולהוסיף את המאגר הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח נמוכה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח גבוהה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LiCl לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE לשטוף חיץ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, להסיר לחלוטין כל חיץ הנותרים. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 4. De-crosslinking של היסטונים ו-DNA, וטיהור של ה-DNA זירז </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μL של חיץ דה crosslinking של גלולה agarose מדגם &quot;קלט&quot; את 40μl משלב 3.4, תערובת של 5min על מערבל מערבולת, דגימות ספין, incuבייט ב 65 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA עם DNA מסחרי או ערכת טיהור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל 5μl של דילול של 1:05 eluate הטור הסופי מספיקים כדי לבצע קונבנציונאלי מוקד ספציפי בזמן אמת כמותי RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5. טבלה של מאגרים </p><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking חיץ</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> 3% (V / V) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 1</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 2</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 3</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.15% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Sonication חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 25mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>נוגדן מחייב חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 50mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>מלח נמוכה לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>מלח גבוהה לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> ליתיום כלוריד </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (V / V) </td></tr><tr><td> נתרן desoxycholate </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>TE לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mm </td></tr></tbody></table><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 6. נציג התוצאות: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי של הגן <em>ארבידופסיס thaliana PR2</em> הגנה קידוד β-1,3-glucanase עם פעילות מיקרוביאלית <sup>12,</sup> הנגרמת על ידי benzothiadiazole (BTH), אנלוגי סינתטי של חומצה סליצילית הורמון צמח <sup>3.</sup> <strong>איור 1</strong> מראה כי הפעלת הביטוי <em>PR2</em> קשורה לעלייה acetylation של שאריות ליזין על היסטון H3 ו-H4 על האמרגן <em>PR2.</em> מאז צפיפות הנוקלאוזום פוחתת במהלך הפעלת הגנים <sup>13,</sup> ערכים acetylation היסטון היו מנורמל עבור האות המתקבל עם נוגדן לאזור משתנה של היסטון 3. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="איור 1"/><br /> <strong>איור 1 BTH גורם acetylation היסטון על האמרגן <em>PR2</em> ב ארבידופסיס.</strong> צמחים שטופלו 100μM BTH או פקד אבקת wettable. לאחר 72h, העלים נאספו הכרומטין היה מבודד. האות המתקבל לאחר משקעים עם נוגדנים ספציפיים acetylation (כמצוין באיור) היה מנורמל לאות מתקבל על ידי משקעים עם נוגדן ל תחום משתנה של היסטון H3. הכרומטין זירז היה לכמת על ידי RT-qPCR. הנתונים סטנדרטי עבור רמות שינוי היסטון בהעדר טיפול BTH. </p>

<ol>
	<li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin.">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em style='font-style: italic'>EMBO rep</em>. <b>3</b>, 224-229 (2002).</li><li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3:+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic.">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <b>25</b>, 15-30 (2007).</li><li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response.">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em style='font-style: italic'>EMBO rep</em>. <b>12</b>, 50-55 (2011).</li><li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter.">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>18</b>, 119-132 (2006).</li><li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize.">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Physiol</em>. <b>141</b>, 1078-1088 (2006).</li><li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis.">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Physiol</em>. <b>143</b>, 1660-1668 (2007).</li><li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+GCN5,+HD1,+and+TAF1/HAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression.">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>18</b>, 2893-2903 (2006).</li><li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+techniques+for+plant+cells.">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Journal</em>. <b>39</b>, 776-789 (2004).</li><li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation.">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em style='font-style: italic'>Trends Biochem. Sci</em>. <b>25</b>, 99-104 (2000).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Meth</em>. <b>3</b>, 11-11 (2007).</li><li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize.">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em style='font-style: italic'>Plant J</em>. <b>53</b>, 465-474 (2008).</li><li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+in+Arabidopsis.">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>4</b>, 645-656 (1992).</li><li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+displacement+in+transcription.">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em style='font-style: italic'>Genes Develop</em>. <b>20</b>, 2009-2017 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אין ניגודי אינטרסים הכריז. </p>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם crosslinking של דנ&quot;א ההיסטונים, סוג וכמות החומר עלה, שחיקה של החומר, ואת sonication של הכרומטין. לדיון מפורט יותר של סוגיות אלה, ראה השופטים. 9 ו -10. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonication ו crosslinking: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לשבש הכרומטין במהלך sonication כדי שברי על 400bp. Sonication ממצה יהרוס הכרומטין ע&quot;י שיבוש דנ&quot;א ההיסטונים, ואילו sonication מספיק יותיר שברים הכרומטין ארוך. אלו משפיעים על סגוליות של השיטה, כי שינויים היסטון דיסטלי של מוקד שנבדקו לא ניתן להפלות בין שינויים מקומיים. יעילות Sonication נבדק הטובה ביותר על ידי איסוף דגימות הכרומטין 20μL לפני ואחרי ה-DNA, דה crosslinking sonication ו ההיסטונים, בידוד דנ&quot;א בקביעת אורכו של ה-DNA טעון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. RNAse יש להוסיף את דגימות לפני אלקטרופורזה, משום הכנה הכרומטין עדיין מכיל כמויות גדולות של RNA בשלב הזה של טיהור שעשוי להפריע להדמיה של ה-DNA מקוטעת. הדגימות שימושיים immunoprecipitation הכרומטין אם דנ&quot;א הכרומטין אי טעון ארוך יותר 10kbp, בעוד ה-DNA של הכרומטין טעון צורות כתם עם עוצמת אות מקסימלית סביב 400bp של ה-DNA. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים באופן שגרתי 3% (v / v) פורמלדהיד עבור crosslinking הכרומטין בעלים שלמים, אבל 1% (v / v) פורמלדהיד עשוי להיות מספיק ברוב המקרים. בידיים שלנו, פורמלדהיד בריכוזים נמוכים מאפשרים פעמים sonication קצר אותות רקע עקב התגובות PCR. עם זאת, כמויות מספיקות של פורמלדהיד לעיתים לגרום reproducibility נמוך של האות PCR בין ניסויים עצמאיים. זה יכול להיות בגלל חדירה מספקת של עלים עם פורמלדהיד בריכוזים נמוכים. הקפד בורסה פורמלדהיד שלך בתדירות גבוהה ככל במתחם נוטה לפלמר עם הזמן. פורמלדהיד פתרונות יציבים רק למשך חודש אחד בערך, וגם זה בקושי תקופה ממושכת על ידי ייצוב מתנול. מומלץ לבדוק את ריכוזי פורמלדהיד שונים בעת הגדרת תנאי הניסוי. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות של חומר צמחי וטחינה: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לחדור כמויות נמוכות של החומר עלה בנפח גדול של חיץ כדי למנוע עלים דבוקים זה לזה. ליף דבק לעתים קרובות תוצאות חדירה מספקת של פורמלדהיד. יתר על כן, חומר צמחי רב מדי יחסום נקבוביות של הרקמה miracloth. יעילות שחיקה ניכרת תלוי בעזרת מכתש ועלי עם התאמה מושלמת. אנו שגרתי לטחון עם העלי חנקן נוזלי מקורר ו מרגמה בהעדר חנקן נוזלי נוספות שלוש פעמים במשך 50 שניות עד החומר הקרקע לאבקה דקה. </p>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> חלבון-A-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 134 515 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> חלבון ה-G-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 243 233 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimethyl-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-דימתיל-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-monomethyl-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> השתמשנו 1μL כדי לבדוק צפיפות היסטון </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD TO-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> רוש </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of histone modifications in plant leaves

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> מבנה הכרומטין חשוב בוויסות של ביטוי גנים אאוקריוטים. בתהליך זה, שיפוץ הכרומטין, מתילציה DNA, שינויים קוולנטיים על אמינו מסוף הזנבות של ההיסטונים H3 ו-H4 ממלאים תפקידים חיוניים <sup>1-2.</sup> H3 ו-H4 שינויים היסטון כוללים מתילציה של ליזין ארגינין, acetylation של ליזין, ו זרחון של שיירי סרין <sup>1-2.</sup> שינויים אלו קשורים גם עם הפעלת הגן, דיכוי, או מדינה ערוכה של הגן התומכת הפעלה מהירה יותר וחזקה הביטוי אחרי תפיסה של אותות המתאים (חיידק הקשורים דפוסי מולקולרית, אור, הורמונים וכו &#39;), <sup>3-7.</sup> </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, אנו מציגים שיטה לגילוי אמין ורגיש של שינויים הכרומטין גנים ספציפיים על הצמח הנבחר. הטכניקה מבוססת על crosslinking של (שינה) היסטונים ו-DNA עם <sup>8,9</sup> פורמלדהיד, מיצוי sonication של הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) עם נוגדנים ספציפיים שינוי <sup>9,10,</sup> דה crosslinking-DNA של היסטון קומפלקסים, ו גנים ספציפיים בזמן אמת PCR כמותי. הגישה הוכיחה שימושי לאיתור שינויים היסטון ספציפיות הקשורות הפוטוסינתזה C <sub>4</sub> ב <sup>5,11</sup> תירס חסינות מערכתי <sup>3</sup> ארבידופסיס. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Histone Modifications in Plant Leaves at JoVE.com

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.</p>

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using <em>Phaseolus vulgaris</em> as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in <em>Arabidopsis</em> Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in <em>Helianthus Annuus</em>

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול <em>בהליוציץ השנתי</em>

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...