Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
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经费是由美国国立卫生研究院/ NIAID补助RO1 - AI - 63457和复苏法案授予补充RO1 - AI - 63457一。我们承认当前和过去的实验组和合作者所有成员的贡献。

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麻风患者皮肤样本收集需要熟练的医师或在皮肤诊所工作的技术人员。处理这些样品的实验室工作人员必须非常小心，穿实验室外套，手套和防护眼镜和处理感染人类或犰狳组织样本时，在一个生物安全柜工作。表面和工具的消毒也很关键。避免污染的DNA样本，在一个干净，无菌的生物安全柜的工作是非常重要的。 提取DNA提取试剂盒从像Qiagen公司公司的发展变得相对容易的感谢。方向，必须认真遵守。所有的样品应当在不使用时保持低温。避免重复样品，极端的温度变化。 在这项工作中使用的DNA引物可下令从各公司已在引在本文末尾的参考文献列表。应采取护理工作与自由的环境中的DNA引物，以避免污染。引物来作为干粉，必须混在一起用TE稀释至100μm的浓度，然后分成小批量（ 图2a） 。引物的工作解决方案，进一步稀释到10μm的浓度。再次，不要用引物使用，并准备在地区/抽油烟机的DNA样本。 PCR产物，也应该在不使用时保持低温。 3％琼脂糖凝胶的制备将提供更好的DNA条带的分离，但需要更长的时间来运行。 2％是纯定性的目的，通常就足够了。溴化乙锭溶液染色的DNA琼脂糖凝胶是一种高活性genotoxin，是通过皮肤吸收。处理这个的解决方案，并它使用非常谨慎，总是一定要戴手套染色凝胶。处理任何DNA样本或溴化乙锭的材料后，彻底洗净双手。处置的溴化乙锭染色溶液，冲洗和凝胶，根据​​机构指引。凝胶是不是经常需要;一旦FLA的方法已经建立，这一步可以消除。它是时间和试剂消耗。 甲酰胺的解决方案，在准备为FLA的样品使用剧毒，应谨慎处理。其使用后要洗手。下列机构的指导方针处理。 读的FLA的结果， 使用峰值的扫描仪软件可以是具有挑战性的。一个等位基因调用（串联重复序列数目）的基本已经拟定了一套在CSU（表 4-7） 。 （应该指出的是， 表4-7可能不是所有的包容性。M.其他菌株麻风研究，可能会发现列出的范围以外的拷贝数的等位基因。）一个特别的挑战，涉及到“口吃“的高峰。这些家庭的高峰，尤其是只涉及2-3个碱基重复，如（TA）10，可疑交易报告，。有时选择了正确的的高峰阅读困难（ 图7） 。在这个数字中，阳性对照在190 bp的高峰是主峰。峰较低的高度，2，4，甚至6个碱基对大于或小于主峰，被称为“口吃峰。”一个拖尾，也可以引起混乱。一个拖尾前面所述的文字和图8。最后，如​​果PCR产物样品中高度丰富，峰值可能出现双穗。在这种情况下，阅读的高峰期形成的中心。 （参见图6，病人6）。 数据管理可以为这种类型的工作任务十分艰巨。重要的是要记录所有相关信息，如所有的实验：一个任务或程序的日期，运营商，带/板地图，FLA的订单，PCR反应条件和配方，凝胶和照片的日期，储存温度，DNA模板稀释的FLA电子文件的存储位置，等良好的组织和数据管理可以节省小时的时间花在寻找特定的信息，在未来。 这里描述的实验室工作已经持续了数年在科罗拉多州立大学和世界各地的其他地点。所有收集到的数据的手段，怎么可能将来使用大图片开始出现。图10A和 10B展示如何将这些DNA指纹图谱可用于区分不同的 M.国家（10A）或什至家庭（10B）之间的麻风菌株。家庭和社区联系在一起案件已被证明携带M.麻风的相似或相同的VNTR应变类型。希望的是，它可能会获得进一步洞察到了麻风的传播模式（S），使早期检测系统的传输网络，可能会为那些人MOS开发在风险吨，而治疗性药物治疗可能会开始前做永久性的神经和皮肤的损害。

<table border="1"><tbody><tr><th>试剂名称</th><th>公司</th><th>目录编号</th><th>评论</th></tr><tr><td> DNeasy的血液和组织套件</td><td> Qiagen公司</td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td>多重PCR套件</td><td> Qiagen公司</td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA引物</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5倍或6倍的凝胶样缓冲液</td><td> New England Biolabs公司</td><td> B7021S </td><td>食谱可让您自己* </td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td>各种</td><td></td><td>从浓度稀释。 </td></tr><tr><td>高狄甲酰胺溶液</td><td>美国应用生物系统公司</td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td>基因扫描-500 LIZ </td><td>美国应用生物系统公司</td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th>设备</th><th>评论</th></tr><tr><td> 2冰箱</td><td> 4 ° C时：1 DNA样本，1对引物和多重试剂</td></tr><tr><td> 1微波炉</td><td>琼脂糖和水加热，使凝胶或合适的方式</td></tr><tr><td> 1高​​压灭菌器</td><td>或消毒材料压力锅</td></tr><tr><td> PCR仪</td><td>热循环</td></tr><tr><td> 2套移液器</td><td> 0.5-10μL，10-100μL，20-200μL，1000μL1引物，1套用于DNA </td></tr><tr><td>潜艇凝胶电泳中</td><td>准备凝胶形式和梳子。 </td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>凝胶中的连接电缆</td></tr><tr><td>加热块</td><td>对于Eppendorf管</td></tr><tr><td>离心分离</td><td> Eppendorf管/条</td></tr><tr><td>毛细管电泳系统（遗传分析仪） </td><td>或访问一个机构，可以进行这种分析</td></tr><tr><td>塑料</td><td>一次性气溶胶的枪头，Eppendorf管中，8条，96孔板，一些光学质量</td></tr><tr><td>计算机与互联网连接</td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

病原体以来， 麻风分枝杆菌 ，不能在实验室中培养了麻风的传播研究是特别困难的。细菌的唯一来源是麻风患者，实验感染的犰狳和裸鼠。因此，许多现代流行病学的方法不适用于麻风病的研究。尽管一个广泛的全球麻风病药物治疗方案，实施由世界卫生组织 1，麻风病仍然在许多国家流行的约25万，每年新发病例。整个 M。 麻风杆菌基因组已经被映射到3,4和许多位点已经确定有2个或更多的碱基对重复段（称为微型和小卫星 ）5 M.临床株麻风许多在这些位点（短串联重复序列，STR）的串联重复片段的数量可能会有所不同 。5,6,7可变数目串联重复序列（VNTR）5分析已经被用来区分不同麻风杆菌菌株。一些位点，似乎比其他人更稳定，显示重复次数少的变化，而其他人似乎更迅速地改变，有时在同一病人。虽然某些VNTRs的变化带来了关于是否适合他们的应变输入7,8,9的问题，新兴的数据表明，分析多个基因位点，这是其稳定性不同，可作为一种宝贵的流行病学工具使用。多个位点的VNTR分析（MLVA）10已被用来研究麻风病的演变，并在几个国家，包括中国 11,12， 马拉维 8， 菲律宾 10,13，和巴西 14传输。 MLVA涉及多个步骤。首先，细菌的DNA是从临床活检或缝皮肤涂片（SSS）与东道国组织DNA提取沿10所需的位点，然后从提取的DNA，通过聚合酶链反应（PCR）扩增。每个反应均采用荧光标记的引物为4-5个不同的基因位点，18个位点共有4个反应扩增 。10 PCR产物可能会受到琼脂糖凝胶电泳验证所需的DNA片段的存在，然后提交的荧光片段长度分析，利用毛细管电泳（FLA）的。从犰狳的DNA作为阳性对照菌传与已知数量的每个位点的重复副本。 FLA色谱研究使用山顶的扫描仪软件和片段长度转换为VNTR副本（等位基因）的数量。最后，VNTR单体型的模式进行了分析，并与病人的临床数据相结合，可用于跟踪应变类型的分布。

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

麻风病，造成<em&gt;麻风分枝杆菌</em&gt;，在许多地方仍然流行。为了了解麻风病的传播蔓延和模式，重要的是要确定应变<em&gt; M。麻风</em&gt;已经感染的病人。可变数目串联重复（VNTR）分型是这样一种方法。

DNA指纹图谱麻风分枝杆菌株使用可变数目串联重复（VNTR） - 片段长度分析（FLA）

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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样品制备<em&gt;结核分枝杆菌</em提取物对核磁共振的代谢组学研究

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

科研

免疫与感染

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

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增长结核分枝杆菌生物膜

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

遗传操纵<em&gt;Δku80</em&gt;株功能基因组分析<em&gt;弓形虫</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

优化的协议<em&gt;麻风分枝杆菌</em&gt;应变管理：冷冻库存保持和维护在无胸腺裸鼠

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

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建立一个<em&gt;在体外</em&gt;系统来研究细胞内的行为<em&gt;光滑念珠菌</em&gt;在人THP-1巨噬细胞

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

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展现着多药耐药<em&gt;结核分枝杆菌</em&gt;扩增基因芯片

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

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Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

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分析18葡萄糖 PET/CT 成像作为研究结核分枝杆菌感染和治疗非人类灵长类动物的工具

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

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报告酶荧光法检测小鼠结核分枝杆菌的影像学

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

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吞噬细胞内复制脓肿分枝杆菌毒力标志物的鉴定

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...