Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

De financiering werd verstrekt door NIH / NIAID verlenen RO1-AI-63457 en de ARRA subsidie ​​aan te vullen RO1-AI-63457 S1. Wij erkennen de bijdragen van alle huidige en vroegere leden van het laboratorium groep en medewerkers.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

De collectie van de huid monsters van lepra patiënten vereist deskundige artsen of technici werken op de huid klinieken. Laboratorium medewerkers die werken met deze monsters moeten besteden veel zorg aan lab jassen, handschoenen en een beschermende bril dragen en om te werken in een bio-safety kast bij de omgang met geïnfecteerde monsters van menselijke of gordeldier weefsel. Desinfectie van oppervlakken en gereedschappen is ook kritisch. Werken in een schone, steriele bio-safe kast is van belang voor het vermijden van verontreiniging van DNA-monsters. DNA-extractie is uitgegroeid tot relatief eenvoudig dankzij de ontwikkeling van de extractie kits van bedrijven als Qiagen. Richtingen moeten zorgvuldig worden opgevolgd. Alle monsters moeten worden bewaard koud wanneer niet in gebruik. Vermijd herhaaldelijk, extreme temperatuurschommelingen voor monsters. DNA-primers gebruikt in dit werk kan worden besteld bij verschillende bedrijven die zijn in de lijst met literatuur referenties aan het einde van deze paper. Voorzichtigheid is geboden om te werken met primers in een DNA-vrije omgeving, om besmetting te voorkomen. Primers komen als droog poeder en moeten worden gemengd met TE en verdund tot een concentratie van 100 urn, dan opgesplitst in kleinere hoeveelheden (Figuur 2a). Werken oplossingen van primers worden verder verdund tot 10μM concentraties. Nogmaals, geen gebruik maken van DNA-monsters in gebieden / kappen waar de primers worden gebruikt en bereid. PCR-producten moeten ook worden bewaard koud wanneer niet in gebruik. Een 3% agarosegel voorbereiding zal geven betere DNA band scheiding, maar duurt het langer te lopen. Voor zuiver kwalitatieve doeleinden, 2% is meestal voldoende. Ethidiumbromide oplossing gebruikt voor het kleuren van de DNA in agarose gels is een zeer actief genotoxin die wordt geabsorbeerd door de huid. Behandel deze oplossing en gels gekleurd met met behulp van grote zorg en altijd zeker om handschoenen te dragen. Handen grondig wassen na het hanteren van een DNA-monsters of ethidiumbromide materialen. Gooi ethidiumbromide kleuroplossing, wassen en gels volgens de institutionele richtlijnen. Gels zijn niet routinematig vereist; deze stap kan worden geëlimineerd zodra FLA methoden zijn vastgesteld. Het is tijd en reagens beslag. De formamide oplossing die wordt gebruikt bij de voorbereiding van monsters voor FLA is ook zeer giftig en moet met zorg worden behandeld. Handen wassen na het gebruik ervan. Gooi het volgende institutionele richtlijnen. Het lezen van de resultaten van het FLA gebruik van Peak Scanner software kan een uitdaging zijn. Een basisset van allel oproepen (aantal tandem repeats) is ontwikkeld bij CSU (tabellen 4-7). (Opgemerkt moet worden dat de tabellen 4-7 misschien niet all inclusive. Als andere stammen van M. leprae worden bestudeerd, allelen met een kopie nummers buiten de vermelde bereik kan worden gevonden.) Een bijzondere uitdaging houdt &#39;stotteren&#39; pieken. Dit zijn families van pieken, vooral van STRs die alleen betrekking 2-3 basepaar herhaalt, zoals (TA) 10. Soms is het selecteren van de juiste piek te lezen is moeilijk (figuur 7). In deze figuur, de piek in de positieve controle op 190 bp is de belangrijkste piek. Pieken lager in hoogte dat zijn 2, 4 of zelfs 6 basenparen groter of kleiner zijn dan de grootste piek worden &#39;stotteren pieken. &quot; A-tailing kan ook leiden tot verwarring. A-tailing is eerder beschreven in de tekst en in figuur 8. Tot slot, als er PCR-producten zijn zeer overvloedig in de monsters, kunnen pieken verschijnen met een dubbele piek. In dit geval, lees dan het midden van de piek te vormen. (Zie Figuur 6, Patiënt 6.) Data management kan een enorme taak voor dit soort werk. Het is belangrijk dat registreert alle relevante informatie voor alle experimenten zoals: de datum van een taak of procedure, operator, strip / plaat kaarten, FLA-orders, PCR-condities en recepten, data van gels en foto&#39;s, opslag temperaturen, DNA-template verdunningen, FLA elektronisch bestand opslaglocaties, etc. Goede organisatie en het data management kan besparen uur van de tijd besteed op zoek naar specifieke delen van informatie in de toekomst. Het laboratorium werk dat hier wordt beschreven is al een aantal jaren bij Colorado State University en op andere locaties in de wereld. Het grote beeld van wat allemaal van de verzamelde gegevens betekent en hoe het kan worden van het toekomstig gebruik begint te ontstaan. Figuren 10A en 10B tonen hoe deze DNA-vingerafdrukken kunnen worden gebruikt om verschillende M. te onderscheiden leprae stammen tussen landen (10A) of zelfs tussen de families (10B). Familie en de gemeenschap gekoppeld gevallen is aangetoond dat M. dragen leprae van soortgelijke of identieke VNTR stam types. De hoop is dat het mogelijk is om meer inzicht te krijgen in de wijze (n) van lepra transmissie, zodat een systeem voor vroegtijdige opsporing van transmissienetwerken kan worden ontwikkeld voor die mensen most in gevaar, en dat curatieve therapie mag aanvangen voordat permanente neurologische en dermatologische schade wordt aangericht.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> DNeasy bloed en weefsel Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Primers </td><td> Verschillende </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosegel </td><td> Verschillende </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x of 6x Gel laadbuffer </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recepten beschikbaar om uw eigen te maken * </td></tr><tr><td> Ethidiumbromide oplossing </td><td> Verschillende </td><td></td><td> Verdunnen van de con. </td></tr><tr><td> Hi-Di Formamide Solution </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Uitrusting </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 2 Koelkasten </td><td> 4 ° C: 1 voor DNA-monsters, 1 voor primers en Multiplex reagentia </td></tr><tr><td> Een magnetron </td><td> Of geschikte manier voor het verwarmen van agarose en water om gels te maken </td></tr><tr><td> Een autoclaaf </td><td> Of snelkookpan voor het steriliseren van materialen </td></tr><tr><td> PCR-machine </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 sets van pipetten </td><td> 0,5 tot 10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ui 1 set voor de primers, een set voor DNA </td></tr><tr><td> Submarine gelelektroforese box </td><td> Met formulieren en kammen voor het bereiden van gels. </td></tr><tr><td> Elektroforese voeding </td><td> Met kabels voor aansluiting op gel box </td></tr><tr><td> Warmteblok </td><td> Voor Eppendorf buisjes </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Voor Eppendorf buizen / strips </td></tr><tr><td> Capillaire elektroforese-systeem (genetische analyse) </td><td> Of toegang tot een instelling die deze analyse kunnen uitvoeren </td></tr><tr><td> Kunststoffen </td><td> Wegwerp spuitbussen pipetpunten, Eppendorf buizen, acht-goed strips, 96-well platen, een aantal van optische kwaliteit </td></tr><tr><td> Computer met internetverbinding </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

De studie van de overdracht van lepra is bijzonder moeilijk omdat de verwekker, Mycobacterium leprae, kan niet worden gekweekt in het laboratorium. De enige bron van de bacterie zijn lepra patiënten en experimenteel geïnfecteerde gordeldieren en naakt muizen. Dus veel van de methoden die worden gebruikt in de moderne epidemiologie zijn niet beschikbaar voor de studie van lepra. Ondanks een uitgebreide wereldwijde medicamenteuze behandeling voor lepra uitgevoerd door de WHO een, lepra nog steeds endemisch in veel landen met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen per jaar. 2 Het hele M. leprae genoom in kaart is gebracht 3,4 en vele loci zijn geïdentificeerd die segmenten van twee of meer basenparen herhaald (de zogenaamde micro-en minisatellieten). Klinische 5 stammen van M. leprae kunnen variëren in het aantal tandem herhaalde segmenten (short tandem repeats, STR) worden veel van deze loci. 5,6,7 variabel aantal tandem repeat (VNTR) 5 analyse is gebruikt om de verschillende stammen van de lepra bacillen te onderscheiden. Sommige van de loci lijken stabieler dan anderen, die minder variatie in aantallen te herhalen, terwijl anderen lijken soms sneller te veranderen, bij dezelfde patiënt. Terwijl de variabiliteit van bepaalde VNTRs heeft opgevoed vragen over hun geschiktheid voor stamtypering 7,8,9, de opkomende gegevens suggereren dat het analyseren van verschillende loci, die zijn divers in hun stabiliteit, kan gebruikt worden als een waardevol epidemiologisch instrument. Meerdere locus VNTR-analyse (MLVA) 10 is gebruikt om lepra evolutie en transmissie in een aantal landen, waaronder China 11,12, Malawi 8, de Filippijnen 10,13, 14 en Brazilië te bestuderen. MLVA omvat meerdere stappen. Eerst wordt bacterieel DNA geëxtraheerd samen met gastheerweefsel DNA van klinische biopsies of spleetogen huid vlekken (SSS). 10 De gewenste loci worden vervolgens geamplificeerd uit het geëxtraheerde DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescent-gelabelde primers 4-5 verschillende loci worden gebruikt per reactie, met 18 loci worden versterkt in een totaal vier reacties. 10 De PCR-producten kan worden onderworpen aan agarosegelelektroforese om de aanwezigheid van het gewenste DNA-segmenten te controleren, en vervolgens ingediend voor TL-fragment length analyse (FLA) met behulp van capillaire elektroforese. DNA van gordeldier gepasseerd bacteriën met een bekend aantal kopieën te herhalen voor elke locus wordt gebruikt als een positieve controle. De FLA chromatogrammen worden vervolgens onderzocht met behulp van Peak Scanner software en fragment lengte is omgezet naar het aantal VNTR exemplaren (allel). Ten slotte worden de VNTR haplotypes geanalyseerd voor patronen en wanneer het wordt gecombineerd met de patiënt klinische gegevens kunnen worden gebruikt om de verdeling van de stam types track.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Lepra, veroorzaakt door<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Is nog steeds endemisch in veel plaatsen. Om te weten te komen over de verspreiding en de wijze van overdracht van lepra, is het van belang te bepalen welke stam van<em&gt; M. leprae</em&gt; Heeft besmet een patiënt. Variabel aantal tandem repeats (VNTR) typering is een dergelijke werkwijze.

DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Monstervoorbereiding van<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Geoptimaliseerde protocollen voor<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: Bevroren Stock Behoud en onderhoud in Athymische Naakt Muizen

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse van 18FDG-PET/CT Imaging als een hulpmiddel voor studeren Mycobacterium tuberculosis infectie en behandeling in niet-menselijke primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...