Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

Le financement a été fourni par le NIH / NIAID octroi RO1-AI-63457 et de l&#39;ARRA subventions complément RO1-AI-63457 S1. Nous reconnaissons les contributions de tous les membres actuels et passés du groupe de laboratoires et des collaborateurs.

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	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

La collecte d&#39;échantillons de peau de patients lépreux nécessite cliniciens qualifiés ou techniciens travaillant dans des cliniques de peau. Les travailleurs de laboratoire manipulant ces échantillons doit prendre grand soin de porter des blouses de laboratoire, des gants et des lunettes de protection et de travailler dans un cabinet de bio-sécurité lors de la manipulation des échantillons de tissus humains infectés ou tatou. Désinfection des surfaces et des outils est également critique. Travailler dans un endroit propre, stérile de bio-sécurité armoire est important pour éviter la contamination des échantillons d&#39;ADN. Extraction de l&#39;ADN est devenu relativement facile grâce au développement de kits d&#39;extraction d&#39;entreprises telles que Qiagen. Des directives doivent être suivies attentivement. Tous les échantillons doivent être conservés au froid lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Évitez répétées, des changements de température extrêmes pour les échantillons. Amorces d&#39;ADN utilisées dans ce travail peut être commandé auprès de diverses entreprises qui ont été cités dans la liste des références bibliographiques à la fin du présent document. Il faut prendre soin de travailler avec des amorces dans un environnement de l&#39;ADN libre, afin d&#39;éviter toute contamination. Primaires viennent sous forme de poudre sèche et doit être mélangé avec TE et dilué à une concentration 100 microns, puis séparés en petites quantités (figure 2a). Les solutions de travail des amorces sont encore dilués à des concentrations 10 uM. Encore une fois, ne pas utiliser des échantillons d&#39;ADN dans les zones / hottes où l&#39;on utilise des amorces et préparés. Les produits de PCR doivent également être conservés au froid lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Un gel d&#39;agarose 3% la préparation donnera une meilleure séparation bande d&#39;ADN, mais prend plus de temps à courir. Pour des raisons purement qualitative, 2% est généralement suffisant. Solution de bromure d&#39;éthidium utilisé pour la coloration de l&#39;ADN dans les gels d&#39;agarose est une génotoxine très actif qui est absorbé par la peau. Manipuler cette solution et les gels colorés avec de l&#39;utiliser le plus grand soin et toujours en étant sûr de porter des gants. Laver soigneusement les mains après avoir manipulé des échantillons d&#39;ADN ou de matériaux de bromure d&#39;éthidium. Eliminer la solution une coloration au bromure d&#39;éthidium, les laver et les gels selon les directives institutionnelles. Les gels sont pas systématiquement requis; cette étape peut être éliminé une fois les méthodes FLA ont été établis. Il est temps et consommer réactif. La solution de formamide utilisées dans la préparation des échantillons pour FLA est également très toxique et doit être manipulé avec soin. Se laver les mains après son utilisation. Débarrassez-vous de la suite des directives institutionnelles. Lecture des résultats du FLA en utilisant le logiciel du scanner de pointe peuvent être difficiles. Un ensemble de base des appels allèle (nombre de répétitions en tandem) a été développée au CSU (tableaux 4-7). (Il convient de noter que tableaux 4-7 peut-être pas tout compris. Comme d&#39;autres souches de M. leprae sont étudiés, avec des allèles nombre de copies en dehors des plages inscrites peuvent être trouvés.) Un défi particulier consiste à &quot;bégayer&quot; pics. Ce sont des familles de pics, en particulier des déclarations de soupçon qui n&#39;impliquent que deux à trois répétitions de paires de bases, telles que (TA) 10. Parfois, la sélection des pics corriger à lire est difficile (figure 7). Dans cette figure, le pic dans le contrôle positif à 190 pb est le pic principal. Inférieure Peaks en hauteur qui sont 2, 4 ou même 6 paires de base plus grande ou plus petite que le pic principal sont appelés «pics bégaiement.&quot; A-tailing peut aussi causer de la confusion. A-tailing est décrit plus haut dans le texte et la figure 8. Enfin, si les produits de PCR sont très abondants dans les échantillons, les pics peuvent apparaître avec un pic double. Dans ce cas, lisez le centre de la forme de pointe. (Voir Figure 6, Patient 6.) La gestion des données peut être une tâche redoutable pour ce type de travail. Il est important d&#39;enregistrer toutes les informations pertinentes pour toutes les expériences telles que: la date d&#39;une tâche ou une procédure, l&#39;opérateur, bandes / plaques cartes, des ordres FLA, des conditions de PCR et les recettes, les dates des gels et des photographies, des températures de stockage, des dilutions matrice d&#39;ADN, FLA électroniques lieux de stockage de fichiers, organisation, etc Bonne gestion des données et peut sauver des heures de temps passé à chercher des éléments d&#39;information dans le futur. Le travail de laboratoire décrit ici a été en cours depuis plusieurs années à la Colorado State University et à d&#39;autres endroits dans le monde. La grande photo de ce que l&#39;ensemble des données recueillies signifie et comment elle peut être d&#39;un usage futur commence à émerger. Figures 10A et 10B montrent comment ces empreintes d&#39;ADN peuvent être utilisés pour distinguer les différentes M. leprae tensions entre les pays (10A), ou même entre les familles (10B). Cas de la famille et la communauté liée a été démontré pour mener M. leprae d&#39;similaires ou identiques types de souches VNTR. L&#39;espoir est que cela peut être possible d&#39;avoir un aperçu plus loin dans le mode (s) de transmission de la lèpre afin qu&#39;un système de détection précoce des réseaux de transmission peuvent être développés pour ces mos de personnest à risque, et que la pharmacothérapie curative peut commencer avant des dommages neurologiques permanents et dermatologiques est fait.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Sang DNeasy et Kit de tissus </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Primers </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel d&#39;agarose </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x ou 6x tampon de chargement de gel </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recettes disponibles pour rendre votre propre * </td></tr><tr><td> Solution de bromure d&#39;éthidium </td><td> Divers </td><td></td><td> Diluer du con. </td></tr><tr><td> Salut-Di Formamide Solution </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Équipement </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 2 Réfrigérateurs </td><td> 4 ° C: 1 pour les échantillons d&#39;ADN, une pour les amorces et les réactifs Multiplex </td></tr><tr><td> 1 four micro-ondes </td><td> Ou de façon appropriée pour le chauffage et l&#39;eau d&#39;agarose pour faire des gels </td></tr><tr><td> 1 autoclave </td><td> Autocuiseur ou pour stériliser des matériaux </td></tr><tr><td> Machine à PCR </td><td> Thermocycleur </td></tr><tr><td> 2 jeux de pipettes </td><td> 0,5 à 10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ul 1 jeu pour les apprêts, 1 jeu de l&#39;ADN </td></tr><tr><td> Submarine boîte électrophorèse sur gel </td><td> Avec des formes et des peignes pour les gels préparation. </td></tr><tr><td> Alimentation d&#39;électrophorèse </td><td> Avec des câbles pour la connexion à la boîte de gel </td></tr><tr><td> Bloc de chaleur </td><td> Pour tubes Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Pour les tubes Eppendorf / bandes </td></tr><tr><td> Système d&#39;électrophorèse capillaire (analyseur génétique) </td><td> Ou l&#39;accès à une institution qui peut effectuer cette analyse </td></tr><tr><td> Plastiques </td><td> Jetable d&#39;aérosol de pipette, tubes Eppendorf, des bandes de 8 puits, des plaques de 96 puits, dont certains de qualité optique </td></tr><tr><td> Un ordinateur avec connexion Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

L&#39;étude de la transmission de la lèpre est particulièrement difficile car l&#39;agent causal, Mycobacterium leprae, ne peuvent pas être cultivées en laboratoire. Les seules sources de la bactérie sont malades de la lèpre et de tatous infectés expérimentalement et des souris nude. Ainsi, de nombreuses méthodes utilisées en épidémiologie moderne ne sont pas disponibles pour l&#39;étude de la lèpre. Malgré un vaste programme mondial de la drogue traitement de la lèpre en œuvre par l&#39;OMS une, la lèpre reste endémique dans de nombreux pays, avec environ 250 000 nouveaux cas chaque année. 2 L&#39;ensemble de M. leprae génome a été cartographié 3,4 et de nombreux locus ont été identifiés qui ont répété les segments de deux ou plusieurs paires de bases (appelés micro et minisatellites). 5 souches cliniques de M. leprae peut varier dans le nombre de segments répétés en tandem (courtes répétitions en tandem, STR) à plusieurs de ces loci. 5,6,7 répéter en tandem en nombre variable (VNTR) 5 analyse a été utilisée pour distinguer les différentes souches du bacille de la lèpre. Certains des loci semblent être plus stables que d&#39;autres, montrant moins de variation dans le nombre le répète, tandis que d&#39;autres semblent évoluer plus rapidement, parfois chez le même patient. Alors que la variabilité de certains VNTR a soulevé des questions quant à leur aptitude à 7,8,9 typage des souches, les nouvelles données indiquent que l&#39;analyse de loci multiples, qui sont diversifiés dans leur stabilité, peut être utilisé comme un outil précieux épidémiologiques. Plusieurs locus VNTR analyse (MLVA) 10 a été utilisé pour étudier l&#39;évolution de la lèpre et la transmission dans plusieurs pays dont la Chine 11,12, au Malawi 8, les Philippines 10,13, et le Brésil 14. MLVA implique plusieurs étapes. Tout d&#39;abord, l&#39;ADN bactérien est extrait avec l&#39;ADN du tissu hôte à partir de biopsies cliniques ou frottis fente (SSS). 10 Le locus désiré sont ensuite amplifiés de l&#39;ADN extrait par réaction en chaîne de polymérase (PCR). Amorces marqués à la fluorescence pour 4-5 loci différents sont utilisés par réaction, avec 18 loci étant amplifié dans un total de quatre réactions. 10 Les produits de PCR peut être soumis à une électrophorèse sur gel d&#39;agarose pour vérifier la présence des segments d&#39;ADN désirée, puis soumis à une analyse de longueur des fragments fluorescents (FLA) par électrophorèse capillaire. ADN de bactéries de tatou passages avec un nombre connu de copies répéter pour chaque locus est utilisé comme contrôle positif. Les chromatogrammes FLA sont ensuite examinés en utilisant le logiciel du scanner Peak et de longueur des fragments est converti en nombre de copies VNTR (allèle). Enfin, les haplotypes VNTR sont analysés pour les modèles, et lorsqu&#39;ils sont combinés avec les données cliniques des patients peuvent être utilisés pour suivre la distribution des types de souches.

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

La lèpre, causée par<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Est encore endémique dans de nombreux endroits. Afin d&#39;en apprendre davantage sur la propagation et le mode de transmission de la lèpre, il est important de déterminer quelle souche de<em&gt; M. leprae</em&gt; A infecté un patient. Nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) frappe est un tel procédé.

L&#39;empreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à l&#39;aide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA)

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