Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

המימון ניתן על ידי NIH / NIAID מענק RO1-AI-63457 ו ערה להעניק תוספת RO1-AI-63457 S1. אנו מכירים את התרומה של כל חברי בעבר ובהווה של הקבוצה מעבדה ומשתפי פעולה.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אוסף דגימות עור מחולים צרעת דורש רופאים מיומנים או טכנאים עובדים במרפאות העור. עובדי המעבדה טיפול דגימות אלה צריכים להקפיד ללבוש חלוקי מעבדה, כפפות ללבוש עין מגן לעבודה בארון ביו בטיחות בעת הטיפול בדגימות של רקמות נגועות אדם או ארמדיל. חיטוי של משטחים וכלים גם קריטי. עבודה ממשלה נקייה, ביו בטוח סטרילי חשוב למניעת זיהום של דגימות DNA. מיצוי DNA הפכה קלה יחסית הודות לפיתוח של ערכות חילוץ מחברות כמו Qiagen. כיווני חייב להיות אחריו בזהירות. כל הדגימות צריך להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הימנע חוזרות ונשנות, שינויי טמפרטורה קיצוניים של הדגימות. Primers DNA המשמשים בעבודה זו ניתן להזמין מחברות שונות אשר צוטטו ברשימת הפניות ספרות בסוף מאמר זה. יש להקפיד לעבוד עם primers בסביבת ה-DNA בחינם על מנת למנוע זיהום. Primers לבוא כמו אבקה יבשה והוא חייב להיות מעורב עם TE ו מדולל לריכוז 100μM, מופרדים מכן לתוך כמויות קטנות (איור 2 א). פתרונות עבודה של primers הם מדולל יותר לריכוזים 10μM. שוב, אין להשתמש דגימות DNA באזורים / ברדסים שם primers משמשים ומוכן. מוצרי ה-PCR צריך גם להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הכנה 3% agarose ג&#39;ל ייתן יותר הלהקה ההפרדה DNA, אבל לוקח יותר זמן לרוץ. לענין איכותי בלבד, 2% מספיקה בדרך כלל. פתרון Ethidium ברומיד המשמש מכתים את ה-DNA בשנת agarose ג&#39;ל הוא genotoxin פעיל מאוד, כי הוא נספג דרך העור. טפל זה הפתרון ג&#39;ל מוכתם אותו באמצעות בזהירות רבה, ותמיד להיות בטוח ללבוש כפפות. לשטוף ידיים ביסודיות לאחר כל טיפול דגימות DNA או חומרים ברומיד ethidium. השלך פתרון מכתים ethidium ברומיד, לרחוץ ג&#39;לים בהתאם להנחיות מוסדיים. ג&#39;ל אינם נדרשים באופן שגרתי; שלב זה אפשר לחסל אחת השיטות FLA הוקמו. זה זמן רב מגיב. הפתרון לפוראמיד המשמשים להכנת דגימות FLA הוא גם רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. רחצו ידיים לאחר השימוש בו. השלך אותו בעקבות הנחיות מוסדיים. קריאת התוצאות של FLA באמצעות תוכנת סורק שיא יכול להיות מאתגר. סט בסיסי של שיחות האלל (מספר חזרות טנדם) פותחה על CSU (לוחות 4-7). (יצוין כי לוחות 4-7 לא יכול להיות הכל כלול. כמו זנים אחרים של M. leprae נלמדים, אללים עם מספרים להעתיק מחוץ טווחי הרשומים ניתן למצוא.) אתגר אחד מסוים כרוך פסגות &quot;לגמגם&quot;. אלו הן משפחות של פסגות, במיוחד של STRs כי רק לערב 2-3 זוג בסיס חוזר, כגון (ת&quot;א) 10. לפעמים בחירה נכונה שיא לקרוא קשה (איור 7). באיור זה, שיא שליטה חיובית 190 נ&quot;ב הוא שיא הראשי. פיקס נמוך בגובה כי הם 2, 4 או אפילו 6 זוגות בסיסים גדולים יותר או קטנים יותר מאשר השיא העיקריים הם בשם &quot;פסגות לגמגם.&quot; A-עוקב יכול גם לגרום לבלבול. A-עוקב מתואר בתחילת הטקסט באיור 8. לבסוף, אם PCR מוצרים נפוצים מאוד הדגימות, פסגות עשויה להופיע עם ספייק כפול. במקרה זה, לקרוא למרכז של הטופס שיא. (ראה תרשים 6, החולה 6.) ניהול נתונים יכולה להיות משימה קשה עבור סוג זה של עבודה. חשוב לתעד כל מידע רלוונטי עבור כל הניסויים, כגון: תאריך של משימה או נוהל, מפעיל, רצועה / צלחת מפות, הזמנות FLA, תנאי PCR ומתכונים, תאריכי ג&#39;לים תצלומים, טמפרטורות האחסון, דילולים תבנית ה-DNA, FLA אחסון קבצים אלקטרוניים מיקומים, וכו &#39;ארגון טוב וניהול נתונים יכול לחסוך שעות של זמן בילה מחפש חלקים מסוימים של מידע בעתיד. העבודה במעבדה המתואר כאן נמשך כבר מספר שנים באוניברסיטת קולורדו ו במקומות אחרים ברחבי העולם. תמונה גדולה של מה כל הנתונים שנאספו באמצעות ואיך זה יכול להיות שימוש עתידי מתחיל להתגלות. איורים 10A ו - 10B להדגים כיצד אלה טביעות DNA יכול לשמש כדי להבדיל מ שונות leprae זנים בין המדינות (10A) או אפילו בין משפחות (10 ב). המשפחה והקהילה המקרים קשור הוכחו נושאים מ leprae סוגי זן דומה או זהה VNTR. התקווה היא כי זה עשוי להיות אפשרי להשיג תובנה נוספת במצב (ים) של שידור צרעת כך מערכת לגילוי מוקדם של רשתות שידור עשוי להיות מפותח עבור אותם אנשים חודשלא בסיכון, וכי טיפול תרופתי מרפא יכולים להתחיל לפני נזק נוירולוגי קבוע עור נעשה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> דם DNeasy וקיט רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DNA primers </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose ג&#39;ל </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> או 5x 6x טוען ג&#39;ל הצפת </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7021S </td><td> זמין כדי להפוך * משלך מתכונים </td></tr><tr><td> Ethidium פתרון ברומיד </td><td> שונים </td><td></td><td> מדולל של קון. </td></tr><tr><td> Hi-Di לפוראמיד פתרון </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ין סריקה -500 ליז </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 2 מקררים </td><td> 4 ° C: 1 עבור דגימות DNA, 1 עבור primers ו ריאגנטים Multiplex </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגל </td><td> או דרך מתאים לחימום agarose ומים כדי להפוך ג&#39;לים </td></tr><tr><td> 1 החיטוי </td><td> או סיר לחץ לעיקור חומרים </td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 סטים של pipettes </td><td> 0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 להגדיר μl 1 עבור primers, 1 להגדיר עבור ה-DNA </td></tr><tr><td> ג&#39;ל אלקטרופורזה תיבת הצוללת </td><td> עם טפסים מסרקים עבור הכנת ג&#39;ל. </td></tr><tr><td> אספקת החשמל אלקטרופורזה </td><td> עם כבלים לחיבור תיבת ג&#39;ל </td></tr><tr><td> מחממים לחסום </td><td> עבור Eppendorf צינורות </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> עבור צינורות Eppendorf / רצועות </td></tr><tr><td> אלקטרופורזה מערכת נימית (מנתח גנטי) </td><td> או גישה למוסד כי ניתן לבצע את הניתוח הזה </td></tr><tr><td> פלסטיקה </td><td> פנויה אירוסול פיפטה טיפים, Eppendorf צינורות, רצועות 8-היטב, צלחות 96-טוב, כמה איכות אופטית </td></tr><tr><td> מחשב עם חיבור לאינטרנט </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

המחקר של השידור של הצרעת הוא קשה במיוחד מאחר הסוכן סיבתי, Mycobacterium leprae, לא יכול להיות מתורבת במעבדה. המקורות רק של חיידקים הם מטופלים צרעת, ארמדילים נגוע בניסוי ועכברים בעירום. לכן, רבים מן השיטות באפידמיולוגיה מודרנית אינם זמינים עבור המחקר של צרעת. למרות תוכנית התרופה נרחב העולמי לטיפול בצרעת מיושם על ידי ארגון הבריאות העולמי 1, צרעת נשאר אנדמי במדינות רבות עם כ 250,000 מקרים חדשים בכל שנה. 2 מ &#39;שלמה leprae הגנום כבר ממופה 3,4 ו לוקוסים רבים זוהו חזרו מקטעים של 2 או יותר זוגות בסיסים (נקרא מיקרו minisatellites). 5 זנים קלינית של מ &#39; leprae עשוי להשתנות במספר מגזרים טנדם חוזרות ונשנות (חזרות טנדם קצרות, STR) בשעה שרבים לוקוסים אלו. 5,6,7 מספר משתנה במקביל לחזור (VNTR) 5 ניתוח נעשה שימוש כדי להבחין בין זנים שונים של החיידקים הצרעת. חלק מהאתרים נראים יציבים יותר מאחרים, מראה וריאציה פחות במספרים חוזרים, בעוד אחרים נראים לשנות במהירות רבה יותר, לפעמים באותו חולה. למרות ההשתנות של VNTRs מסוים הביא את שאלות לגבי התאמתם הקלדה זן 7,8,9, הנתונים מראים כי ניתוח המתעוררים לוקוסים מרובים, שהם מגוונים היציבות שלהם, יכול לשמש ככלי אפידמיולוגי יקר. מספר מוקד VNTR ניתוח (MLVA) 10 נעשה שימוש כדי ללמוד את תורת האבולוציה צרעת והעברת במספר מדינות כולל סין 11,12, 8 מלאווי, פיליפינים 10,13, 14 ו ברזיל. MLVA כרוך שלבים מרובים. ראשית, ה-DNA חיידקי מופק יחד עם ה-DNA המארח רקמה ביופסיות עור קליני או חריץ מריחות (SSS). 10 לוקוסים הרצוי ואז הם מוגבר באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מ-DNA המחולץ. Primers fluorescently שכותרתו עבור לוקוסים שונים 4-5 משמשים לכל תגובה, עם 18 לוקוסים להיות מוגבר בסך של ארבע תגובות. 10 המוצרים PCR עשוי להיות נתון ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לוודא את נוכחותו של המגזרים ה-DNA הרצוי, ולאחר מכן הגישה לניתוח פלורסנט אורך קטע (FLA) באמצעות אלקטרופורזה נימי. דנ&quot;א ארמדיל passaged חיידקים עם מספר ידוע של עותקים חוזרים עבור כל מוקד משמש כביקורת חיובית. Chromatograms FLA נבחנים אז באמצעות תוכנה סורק שיא אורך קטע מומר מספר העותקים VNTR (אלל). לבסוף, haplotypes VNTR מנותחים על דפוסים בשילוב עם נתונים קליניים המטופל יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפלגות סוגי המתח.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

צרעת, הנגרמת על ידי<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של<em&gt; מ leprae</em&gt; נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.

טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

פרוטוקולים אופטימליים עבור<em&gt; Leprae Mycobacterium</em&gt; ניהול הזנים: קפוא במלאי שימור ותחזוקה בעכברים בעירום athymic

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...