Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

O financiamento foi fornecido pelo NIH / NIAID conceder RO1-AI-63457 e conceder ARRA suplemento RO1-AI-63457 S1. Reconhecemos as contribuições de todos os membros atuais e anteriores do grupo de laboratório e colaboradores.

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Não há conflitos de interesse declarados.

A coleta de amostras de pele de pacientes com hanseníase exige clínicos qualificados ou técnicos que trabalham em clínicas da pele. Pessoal de laboratório manipulando essas amostras devem tomar muito cuidado para vestir jalecos, luvas e óculos de proteção e de trabalhar em um gabinete de bio-segurança ao manusear amostras de tecido humano infectado ou tatu. Desinfecção de superfícies e ferramentas também é crítica. Trabalhando em um ambiente limpo, gabinete bio-segurança estéril é importante para evitar a contaminação de amostras de DNA. Extração de DNA tornou-se relativamente fácil, graças ao desenvolvimento de kits de extração de empresas como a Qiagen. Direções devem ser seguidas rigorosamente. Todas as amostras devem ser mantidas frio quando não em uso. Evite a repetição, mudanças extremas de temperatura para as amostras. Primers DNA utilizado neste trabalho pode ser encomendado a partir de várias empresas que foram citadas na lista de referências bibliográficas no final deste artigo. Cuidados devem ser tomados para trabalhar com primers de DNA em um ambiente livre, a fim de evitar a contaminação. Primers vir na forma de pó seco e deve ser misturado com TE e diluído a uma concentração 100μM, em seguida, separada em quantidades menores (Figura 2a). Soluções de trabalho de primers são ainda mais diluído em concentrações 10μM. Mais uma vez, não usam amostras de DNA em áreas / capuzes onde primers são usados ​​e preparados. Os produtos de PCR também deve ser mantido frio quando não em uso. A 3% agarose gel preparação dará melhor separação da banda DNA, mas demora mais tempo para ser executado. Para fins puramente qualitativa, 2% é geralmente suficiente. Solução de brometo de etídio utilizado para a coloração do DNA em gel de agarose é um genotoxin altamente ativa que é absorvida através da pele. Lidar com esta solução e géis corados com ele usando muito cuidado e sempre tendo a certeza de usar luvas. Lave bem as mãos após manusear qualquer DNA de amostras ou materiais brometo de etídio. Dispor de etídio solução corante brometo, lave e géis de acordo com as diretrizes institucionais. Géis não são rotineiramente necessárias; esta etapa pode ser eliminada de uma vez métodos FLA foram estabelecidas. É tempo e consumindo reagente. A solução formamida utilizados na preparação de amostras para FLA também é altamente tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Lavar as mãos após o uso. Descartá-lo seguindo as diretrizes institucionais. Leitura dos resultados da FLA usando o software de scanner de pico pode ser desafiador. Um conjunto básico de chamadas alelos (número de repetições em tandem) foi desenvolvido no CSU (Tabelas 4-7). (Note-se que os quadros 07/04 pode não ser tudo incluído. Como outras cepas de M. leprae são estudados, os alelos com números de cópia fora dos intervalos listados podem ser encontrados.) Um desafio particular envolve &#39;gaguejar&#39; picos. São famílias de picos, especialmente dos STRs que envolvem apenas repete 2-3 pares de base, tais como (TA) 10. Às vezes, selecionando o pico correto de ler é difícil (Figura 7). Nesta figura, o pico no controle positivo em 190 bp é o pico principal. Picos mais baixos de altura que são 2, 4 ou mesmo 6 pares de bases maiores ou menores do que o pico principal são chamados &quot;picos de gaguejar.&quot; A-rejeito também pode causar confusão. A-rejeito é descrito anteriormente no texto e na Figura 8. Finalmente, se produtos de PCR são muito abundantes nas amostras, os picos podem aparecer com um pico duplo. Neste caso, leia o centro do pico de forma. (Veja a Figura 6, paciente 6). Gerenciamento de dados pode ser uma tarefa formidável para esse tipo de trabalho. É importante registrar todas as informações pertinentes para todos os experimentos, tais como: data de uma tarefa ou procedimento, a operadora, tira / chapa de mapas, ordens FLA, as condições de PCR e receitas, datas de géis e fotografias, temperaturas de armazenamento, diluições modelo de DNA, FLA locais de armazenamento de arquivo eletrônico, etc Uma boa organização e gerenciamento de dados podem salvar horas de tempo gasto à procura de informações específicas no futuro. O trabalho de laboratório descritas aqui vem acontecendo há vários anos na Colorado State University e em outras localidades ao redor do mundo. O grande retrato do que todos os dados coletados significa e como ela pode ser de uso futuro está começando a emergir. Figuras 10A e 10B demonstram como estas impressões digitais de DNA pode ser usado para distinguir diferentes M. leprae tensões entre países (10A) ou mesmo entre as famílias (10B). Família e na comunidade casos relacionados foram mostrados para transportar M. leprae de tipos de tensão semelhante ou idêntico VNTR. A esperança é que isso pode ser possível obter mais conhecimentos sobre o modo (s) de transmissão da hanseníase para que um sistema de detecção precoce de redes de transmissão pode ser desenvolvida para aqueles mos pessoast em risco, e que a terapia de droga curativa pode começar antes que os danos neurológicos e dermatológicos permanente é feito.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Sangue Dneasy e Kit Tissue </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> Primers do DNA </td><td> Vários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de agarose </td><td> Vários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampão de carregamento 5x ou 6x Gel </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Receitas disponíveis para fazer a sua própria * </td></tr><tr><td> Solução de brometo de etídio </td><td> Vários </td><td></td><td> Diluir de con. </td></tr><tr><td> Oi-Di Solução Formamida </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene digitalização -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 2 Refrigeradores </td><td> 4 ° C: 1 para amostras de DNA, 1 de primers e reagentes Multiplex </td></tr><tr><td> Um forno de microondas </td><td> Ou uma maneira adequada para o aquecimento agarose e água para fazer géis </td></tr><tr><td> Uma autoclave </td><td> Ou panela de pressão para esterilizar materiais </td></tr><tr><td> Máquina de PCR </td><td> Termociclador </td></tr><tr><td> 2 conjuntos de pipetas </td><td> 0,5-10 mL, 10-100 mL, 2-20 mL, 1000 set 1 ml de primers, um conjunto de DNA </td></tr><tr><td> Caixa de eletroforese em gel de submarinos </td><td> Com formas e pentes para preparar géis. </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação de eletroforese </td><td> Com cabos para ligação à caixa de gel </td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td> Para tubos Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Para tubos Eppendorf / tiras </td></tr><tr><td> Sistema de eletroforese capilar (analisador de genética) </td><td> Ou o acesso a uma instituição que pode realizar esta análise </td></tr><tr><td> Plásticos </td><td> Descartáveis ​​aerosol ponteiras, tubos Eppendorf, tiras de 8 poços, placas de 96 poços, alguns de qualidade óptica </td></tr><tr><td> Computador com ligação à Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

O estudo da transmissão da hanseníase é particularmente difícil, pois o agente causador, o Mycobacterium leprae, não podem ser cultivadas em laboratório. As únicas fontes de bactérias são pacientes de hanseníase, e tatus infectados experimentalmente e camundongos nude. Assim, muitos dos métodos utilizados em epidemiologia moderna não estão disponíveis para o estudo da hanseníase. Apesar de um programa de tratamento global de drogas extensa para a lepra implementado pela OMS 1, a hanseníase ainda é endêmica em muitos países, com aproximadamente 250.000 casos novos a cada ano. 2 A M. inteira leprae genoma foi mapeado 3,4 e muitos loci foram identificados que têm repetido segmentos de 2 ou mais pares de bases (chamada de micro e minissatélites). 5 cepas clínicas de M. leprae podem variar no número de segmentos em tandem repetidas (repetições em tandem curtas, STR) em muitos destes loci. 5,6,7 tandem repeat número variável (VNTR) 5 análise tem sido utilizada para distinguir diferentes cepas do bacilo da lepra. Alguns dos loci parecem ser mais estáveis ​​do que outros, mostrando uma menor variação no número de repetir, enquanto outros parecem mudar mais rapidamente, às vezes em um mesmo paciente. Enquanto a variabilidade dos VNTRs certas trouxe à tona questões sobre a sua adequação para a digitação tensão 7,8,9, os dados emergentes sugerem que a análise de múltiplos locais, que são diferentes em sua estabilidade, pode ser usado como uma valiosa ferramenta epidemiológica. Múltiplos lócus VNTR análise (MLVA) 10 tem sido usado para estudar a evolução da hanseníase e de transmissão em vários países, incluindo China 11,12, Malawi 8, Filipinas 10,13, e Brasil 14. MLVA envolve várias etapas. Primeiro, o DNA bacteriano é extraído juntamente com o DNA do hospedeiro de tecido de biópsias clínicas ou manchas da pele de fenda (SSS). 10 O loci desejado são amplificados a partir do DNA extraído por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR). Primers fluorescentes marcado por 4-5 loci diferentes são usados ​​por reação, com 18 loci sendo amplificado em um total de quatro reações. 10 Os produtos de PCR pode ser submetido a eletroforese em gel de agarose para verificar a presença dos segmentos de DNA desejado, e então submetidos para análise fluorescentes fragmento de comprimento (FLA), utilizando eletroforese capilar. DNA de bactérias tatu várias passagens com um número conhecido de cópias de repetição para cada locus é usado como um controle positivo. Os cromatogramas FLA são então analisados ​​usando o software de scanner de pico e de comprimento de fragmentos é convertido em número de cópias VNTR (alelo). Finalmente, os haplótipos VNTR são analisados ​​por padrões, e quando combinados com os dados clínicos do paciente pode ser usado para controlar distribuição dos tipos de tensão.

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Hanseníase, causada pelo<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Ainda é endêmica em muitos lugares. A fim de aprender sobre a propagação e modo de transmissão da hanseníase, é importante para determinar qual a tensão de<em&gt; M. leprae</em&gt; Contaminou um paciente. Número variável de repetições em tandem (VNTR) a digitação é um tal método.

Impressões Digitais de DNA de Mycobacterium leprae Estirpes Usando Repita Tandem número variável (VNTR) - Análise Fragmento (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

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