Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

Финансирование было предоставлено NIH / NIAID грант RO1-AI-63457 и ARRA гранта дополнения RO1-AI-63457 S1. Мы признаем вклад всех текущих и прошлых членов группы лабораторий и сотрудников.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Коллекция образцов кожи от больных лепрой требует квалифицированных врачей и техников, работающих при кожных клиник. Сотрудники лаборатории обработки этих образцов должны проявлять большую осторожность, чтобы носить халаты, перчатки и защитные очки и работать в биологической безопасности при работе кабинета инфицированных образцов тканей человека или броненосца. Дезинфекция поверхностей и инструментов, также имеет важное значение. Работа в чистую, стерильную био-безопасной шкаф имеет важное значение для предотвращения загрязнения образцов ДНК. Экстракции ДНК стала сравнительно легко благодаря развитию добычи комплекты от таких компаний, как Qiagen. Направления необходимо соблюдать. Все образцы должны быть холодно, когда он не используется. Избегайте повторных, резкими перепадами температуры для образцов. ДНК, праймеры, используемые в этой работе можно заказать из разных компаний, которые были названы в списке литературы ссылки в конце этой статьи. Следует проявлять осторожность, чтобы работать с грунтовки в ДНК свободной среде, с тем чтобы избежать загрязнения. Грунтовки приходят в виде сухого порошка и должны быть смешаны с ТЕ-и разбавляют до 100 мкм концентрация, затем разделяется на меньших количествах (рис. 2а). Рабочие растворы праймеров далее разбавляют до 10 мкм концентрациях. Опять же, не использовать образцы ДНК в районах / вытяжки, где грунтовки используются и подготовлены. ПЦР-продукты также должны быть не холодно, когда он не используется. 3% агарозном геле подготовка даст лучшего разделения ДНК группе, но занимает больше времени для запуска. Для чисто качественные цели, 2%, как правило, достаточно. Этидия бромид раствор, используемый для окрашивания ДНК в агарозном гелях высокой активностью genotoxin, что поступает в организм через кожу. Ручка этого решения и гели окрашивали ее с помощью особой тщательностью и всегда быть уверенным в перчатках. Тщательно мойте руки после работы с любой образцы ДНК или этидия материалов метила. Утилизировать этидия решение окрашивания метила, вымыть и гели в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Гели обычно не требуется, этот шаг может быть устранена раз FLA методы были созданы. Пора и реагента затрат. Формамида решения, использованные при подготовке проб для FLA также является высокотоксичным веществом и должны использоваться с большой осторожностью. Мойте руки после использования. Утилизировать его следующие организационные принципы. Чтение результатов FLA использованием Пик программное обеспечение сканера может оказаться непростой задачей. Базовый набор аллелей звонков (число тандемных повторов) была разработана в ХСС (Таблицы 4-7). (Следует отметить, что Таблицы 4-7, возможно, не все включено. Как и другие штаммы Микобактерии лепры изучаются аллелей с копией населением за пределами диапазона перечисленных могут быть найдены.) Одна конкретная задача включает в себя «заикаться» пиков. Это семьи пиков, особенно СПО, что только привлечь 2-3 пар оснований повторяется, например, (ТП) 10. Иногда правильно выбрать пик читать трудно (рис. 7). На этом рисунке, пик положительного контроля при 190 б.п. является основной пик. Пики ниже в высоту, 2, 4 или даже 6 пар оснований больше или меньше, чем основной пик называют &quot;пики заикаться. -Хвосты также может привести к путанице. -Хвосты описано ранее в тексте и на рисунке 8. Наконец, если продукты ПЦР весьма распространены в образцах, пики могут появляться с двойным шип. В этом случае, читайте центре пик формы. (См. рисунок 6, Пациент 6.) Управление данными может быть трудной задачей для этого вида работ. Важно записать всю необходимую информацию для всех экспериментов, таких как: дата задачи или процедуры, оператора, полоса / пластины карты, FLA заказов, условия ПЦР и рецепты, даты гели и фотографии, температура хранения, разведения ДНК-матрицы, FLA электронный файл мест хранения и т.д. Хорошая организация и управление данными может сэкономить часы времени, затрачиваемого ищете конкретную часть информации в будущем. Лабораторные работы, описанные здесь продолжается уже на протяжении нескольких лет в Университете штата Колорадо и в других местах по всему миру. Большая картина того, что все собранные данные средства и как она может быть будущего использования начинает появляться. Цифры 10А и 10В продемонстрировать, как эти ДНК, отпечатки пальцев могут быть использованы для выделения различных М. лепры штаммов между странами (10A), или даже между семьями (10В). В семье и общине связанные случаи были показаны нести М. лепры подобных или идентичных типов VNTR напряжения. Надеюсь, что это может быть возможным, чтобы получить дальнейшее понимание режим (ы) передачи проказы, так что система раннего обнаружения сетей передачи могут быть разработаны для тех людей, мест в опасности, и что лечебной терапии препарат может начаться до постоянного неврологического и дерматологического причинен ущерб.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> DNeasy крови и тканей Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Мультиплекс ПЦР Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> ДНК праймеры </td><td> Различный </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Агарозном геле </td><td> Различный </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 или 6 раз буфера Гель Загрузка </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Рецепты доступны сделать свой собственный * </td></tr><tr><td> Бромистый этидий решение </td><td> Различный </td><td></td><td> Развести из рассмотрения. </td></tr><tr><td> Привет-Ди формамид решения </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Гена сканирования -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Оборудование </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> 2 Холодильники </td><td> 4 ° C: 1 для образцов ДНК, 1 для грунтовки и Мультиплекс реагентов </td></tr><tr><td> 1 микроволновой печи </td><td> Или подходящий способ для отопления агарозы и воды, чтобы сделать гели </td></tr><tr><td> 1 автоклаве </td><td> Или скороварки для стерилизации материалов </td></tr><tr><td> ПЦР машины </td><td> Термоциклер </td></tr><tr><td> 2 комплекта пипетки </td><td> 0.5-10 мкл, 10-100 мкл, 20-200 мкл, 1000 мкл 1 комплект для грунтовки, 1 набор для ДНК </td></tr><tr><td> Подводные поле гель-электрофореза </td><td> С формами и расчески для подготовки гелей. </td></tr><tr><td> Электрофорез питания мощностью </td><td> С кабелями для подключения к геля окне </td></tr><tr><td> Тепло блок </td><td> Для Эппендорф труб </td></tr><tr><td> Центрифуга </td><td> Для Эппендорф труб / полосы </td></tr><tr><td> Капиллярной системы электрофореза (генетические анализатор) </td><td> Или доступ к учреждению, которые могут выполнять этот анализ </td></tr><tr><td> Пластики </td><td> Одноразовые наконечники аэрозоля, Эппендорф труб, 8-и полос, 96-луночных планшетах, некоторые из оптического качества </td></tr><tr><td> Компьютер с подключением к интернету </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory. The only sources of the bacteria are leprosy patients, and experimentally infected armadillos and nude mice. Thus, many of the methods used in modern epidemiology are not available for the study of leprosy. Despite an extensive global drug treatment program for leprosy implemented by the WHO1, leprosy remains endemic in many countries with approximately 250,000 new cases each year.2 The entire M. leprae genome has been mapped3,4 and many loci have been identified that have repeated segments of 2 or more base pairs (called micro- and minisatellites).5 Clinical strains of M. leprae may vary in the number of tandem repeated segments (short tandem repeats, STR) at many of these loci.5,6,7 Variable number tandem repeat (VNTR)5 analysis has been used to distinguish different strains of the leprosy bacilli. Some of the loci appear to be more stable than others, showing less variation in repeat numbers, while others seem to change more rapidly, sometimes in the same patient. While the variability of certain VNTRs has brought up questions regarding their suitability for strain typing7,8,9, the emerging data suggest that analyzing multiple loci, which are diverse in their stability, can be used as a valuable epidemiological tool. Multiple locus VNTR analysis (MLVA)10 has been used to study leprosy evolution and transmission in several countries including China11,12, Malawi8, the Philippines10,13, and Brazil14. MLVA involves multiple steps. First, bacterial DNA is extracted along with host tissue DNA from clinical biopsies or slit skin smears (SSS).10 The desired loci are then amplified from the extracted DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescently-labeled primers for 4-5 different loci are used per reaction, with 18 loci being amplified in a total of four reactions.10 The PCR products may be subjected to agarose gel electrophoresis to verify the presence of the desired DNA segments, and then submitted for fluorescent fragment length analysis (FLA) using capillary electrophoresis. DNA from armadillo passaged bacteria with a known number of repeat copies for each locus is used as a positive control. The FLA chromatograms are then examined using Peak Scanner software and fragment length is converted to number of VNTR copies (allele). Finally, the VNTR haplotypes are analyzed for patterns, and when combined with patient clinical data can be used to track distribution of strain types.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Проказа, вызванных<em&gt; Микобактерии лепры</em&gt;, По-прежнему эндемичных во многих местах. Для того, чтобы узнать о распространении и способ передачи инфекции от проказы, важно определить, какой штамм<em&gt; М. лепры</em&gt; Заразил пациента. Переменная числа тандемных повторов (VNTR) набрав является одним из таких методов.

Снятие отпечатков пальцев ДНК из Микобактерии лепры Штаммы Использование переменных Повторите Тандем номер (VNTR) - Анализ фрагментов Длина (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Пример подготовки<em&gt; Микобактерий туберкулеза</em&gt; Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Генетические манипуляции<em&gt; Δku80</em&gt; Штаммов для функционального геномного анализа<em&gt; Токсоплазма</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Оптимизированные протоколы для<em&gt; Микобактерией лепры</em&gt; Штамм Управление: Замороженные со сохранения и поддержания у бестимусных голых мышей

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...