Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

El financiamiento fue proporcionado por el NIH / NIAID subvención RO1-AI-63457 y concesión de suplemento de ARRA SR1-AI-63457 S1. Reconocemos las contribuciones de todos los miembros actuales y pasados ​​del grupo de laboratorios y colaboradores.

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La recogida de muestras de piel de pacientes con lepra requiere médicos clínicos especializados o técnicos que trabajan en las clínicas de la piel. Los trabajadores de laboratorio que manipula las muestras deben tener mucho cuidado al usar batas, guantes y protección para los ojos y trabajar en un gabinete de bioseguridad al manipular muestras de tejido humano infectado o armadillo. Desinfección de superficies y herramientas también es fundamental. Trabajar en un lugar limpio, estéril bio-seguridad del gabinete es importante para evitar la contaminación de las muestras de ADN. La extracción de ADN se ha convertido en relativamente fácil gracias al desarrollo de kits de extracción de empresas como Qiagen. Instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente. Todas las muestras deben mantenerse en frío, cuando no esté en uso. Evitar la repetición, cambios extremos de temperatura para las muestras. Cebadores de ADN utilizado en este trabajo se pueden pedir de varias empresas que han sido citados en la lista de referencias bibliográficas al final de este documento. Se debe tener cuidado al trabajar con los primers en un ambiente libre de ADN con el fin de evitar la contaminación. Cebadores vienen en forma de polvo seco y se debe mezclar con TE y se diluye a una concentración de 100μM, se separa en cantidades más pequeñas (Figura 2a). Las soluciones de trabajo de los cebadores se vuelve a diluir a concentraciones de 10μM. Una vez más, no utilizan las muestras de ADN en las áreas / campanas que se utilizan cebos y preparados. Los productos de PCR también deben mantenerse en frío, cuando no esté en uso. Un 3% de agarosa preparación del gel le dará una mejor separación de las bandas de ADN, pero tarda más en ejecutarse. Con fines puramente cualitativa, el 2% es suficiente. Solución de bromuro de etidio utilizado para teñir el ADN en geles de agarosa es una genotoxina muy activo que se absorbe por la piel. Manejar esta solución y geles teñidos con él usando mucho cuidado y estar siempre asegúrese de usar guantes. Lávese las manos minuciosamente después de manipular el ADN de muestras o materiales de bromuro de etidio. Disponer de una solución de tinción con bromuro de etidio, lavar y geles de acuerdo con las directrices institucionales. Geles no son habitualmente requeridos, este paso puede ser eliminada una vez métodos FLA se han establecido. Es mucho tiempo y reactivos. La solución de formamida utilizados en la preparación de muestras para la FLA es también muy tóxico y debe ser manejado con cuidado. Lávese las manos después de su uso. Disponer de ella siguiendo las directrices institucionales. Lectura de los resultados de la FLA utilizando el software del escáner pico puede ser un reto. Un conjunto básico de llamadas alelos (número de repeticiones en tándem) ha sido desarrollado en CSU (Tablas 4-7). (Cabe señalar que los cuadros 7.4 no sea definitiva. Como otras cepas de M. leprae se estudian, los alelos con el número de copias fuera de los rangos mencionados pueden ser encontrados.) Uno de los retos en particular es &quot;tartamudeo&quot; picos. Estas son las familias de los picos, sobre todo de los ROS que sólo implican 2-3 repeticiones de pares de bases, tales como (TA) 10. A veces la selección de la punta correcta para leer es difícil (Figura 7). En esta figura, el pico en el control positivo de 190 pb es el pico principal. Picos más bajos de altura, que son 2, 4, o incluso 6 pares de bases de mayor o menor que el pico principal se denominan &quot;picos de tartamudear. A-cola también puede causar confusión. A-cola se ha descrito anteriormente en el texto y en la Figura 8. Por último, si los productos de PCR son muy abundantes en las muestras, los picos pueden aparecer con un aumento doble. En este caso, lea el centro de la forma de pico. (Ver Figura 6, los pacientes 6.) Gestión de datos puede ser una tarea formidable para este tipo de trabajo. Es importante registrar toda la información pertinente para todos los experimentos, tales como: fecha de una tarea o procedimiento, el operador tira / la placa de los mapas, las órdenes de FLA, las condiciones de PCR y las recetas, las fechas de los geles y las fotografías, las temperaturas de almacenamiento, las diluciones de ADN de la plantilla, FLA lugares de almacenamiento de archivos electrónicos, etc organización y una gestión de datos puede ahorrar horas de tiempo dedicado a buscar información específica en el futuro. El trabajo de laboratorio se describe aquí ha estado ocurriendo desde hace varios años en la Universidad Estatal de Colorado y en otros lugares alrededor del mundo. La imagen grande de lo que todos los datos recogidos medios y la forma en que pueden ser de uso en el futuro está empezando a surgir. Figuras 10A y 10B muestran cómo estas huellas de ADN se pueden utilizar para distinguir diferentes M. leprae entre los países (10A) o incluso entre las familias (10B). Casos de la familia y la comunidad vinculada Se ha demostrado que para llevar a M. leprae de tipos de cepas similares o idénticos VNTR. La esperanza es que tal vez sea posible para obtener una mayor comprensión del modo (s) de transmisión de la lepra, para que un sistema de detección precoz de las redes de transmisión puede ser desarrollado para los meses la gentet en situación de riesgo, y que el tratamiento farmacológico curativo puede comenzar antes de daño neurológico permanente y dermatológicos que se hace.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> Cartilla de ADN </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> En gel de agarosa </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de 5x o 6x tampón de carga </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recetas disponibles para hacer su propia * </td></tr><tr><td> Solución de bromuro de etidio </td><td> Varios </td><td></td><td> Diluir en contra. </td></tr><tr><td> Hi-Di formamida Solución </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene exploración -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 2 refrigeradores </td><td> 4 ° C: 1 para las muestras de ADN, uno de los cebadores y reactivos Multiplex </td></tr><tr><td> Un horno de microondas </td><td> O la manera adecuada para la calefacción de agarosa y agua para hacer geles </td></tr><tr><td> Un autoclave </td><td> O de olla a presión para la esterilización de los materiales </td></tr><tr><td> PCR máquina </td><td> Termociclador </td></tr><tr><td> 2 juegos de pipetas </td><td> 0,5-10 l, l 10-100, 20-200 l, 1000 l 1 juego de primers, 1 juego de ADN </td></tr><tr><td> Gel de electroforesis submarina caja </td><td> Con las formas y peines para la preparación de los geles. </td></tr><tr><td> Electroforesis de la fuente de alimentación </td><td> Con cables para la conexión a la caja de gel </td></tr><tr><td> Bloque de calor </td><td> Para tubos Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Para los tubos Eppendorf / tiras </td></tr><tr><td> Sistema de electroforesis capilar (analizador genético) </td><td> O el acceso a una institución que puede realizar este análisis </td></tr><tr><td> Plásticos </td><td> Aerosol desechables puntas de pipeta, tubos Eppendorf, tiras de 8 pocillos, placas de 96 pozos, algunos de calidad óptica </td></tr><tr><td> Ordenador con conexión a Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

El estudio de la transmisión de la lepra es particularmente difícil, ya que el agente causal, Mycobacterium leprae, no se pueden cultivar en el laboratorio. Las únicas fuentes de las bacterias son los enfermos de lepra, y armadillos infectados experimentalmente y los ratones desnudos. Así, muchos de los métodos utilizados en la epidemiología moderna no están disponibles para el estudio de la lepra. A pesar de un extenso programa global de tratamiento de drogas para la lepra implementado por la OMS 1, la lepra sigue siendo endémica en muchos países, con aproximadamente 250.000 nuevos casos cada año. 2 Toda la M. leprae genoma ha sido mapeado 3,4 y muchos loci han sido identificados que han repetido los segmentos de dos o más pares de bases (llamados micro y minisatélites). 5 cepas clínicas de M. leprae puede variar en el número de segmentos repetidos en tándem (repeticiones cortas en tándem, STR) en muchos de estos lugares. 5,6,7 repetir tándem número variable (VNTR) 5 de análisis se ha utilizado para distinguir las diferentes cepas del bacilo de la lepra. Algunos de los lugares parecen ser más estables que otros, que muestran una menor variación en el número de repeticiones, mientras que otros parecen cambiar más rápidamente, a veces en el mismo paciente. Mientras que la variabilidad de ciertas VNTRs ha planteado preguntas acerca de su idoneidad para la tipificación de cepas 7,8,9, los datos emergentes sugieren que el análisis de múltiples loci, que son diversos en su estabilidad, se puede utilizar como una herramienta epidemiológica útil. Múltiples locus VNTR análisis (MLVA) 10 se ha utilizado para estudiar la evolución de la lepra y la transmisión en varios países incluyendo a China 11,12, 8 Malawi, Filipinas 10,13, y Brasil 14. MLVA implica varios pasos. En primer lugar, el ADN bacteriano se extrae junto con el ADN del huésped de tejido de biopsias clínicas o manchas raja la piel (SSS). El 10 loci deseados se amplifican a partir del ADN extraído a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Cebadores fluorescente marcada por 4-5 diferentes loci se utilizan por reacción, con 18 loci que se amplifica en un total de cuatro reacciones. 10 Los productos de PCR puede ser sometido a electroforesis en gel de agarosa para verificar la presencia de los segmentos de ADN deseada, y luego presentado para el análisis de fluorescencia de longitud de fragmentos (FLA) mediante electroforesis capilar. ADN de las bacterias armadillo pasajes con un número conocido de copias de repetición para cada locus se utiliza como control positivo. Los cromatogramas FLA son examinados usando el software del escáner de pico y la longitud del fragmento se convierte en el número de copias VNTR (alelo). Finalmente, los haplotipos VNTR se analizan los patrones, y cuando se combina con los datos clínicos del paciente puede ser usado para rastrear la distribución de los tipos de cepa.

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

La lepra, causada por<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Sigue siendo endémica en muchos lugares. Con el fin de aprender acerca de la propagación y el modo de transmisión de la lepra, es importante determinar qué cepa del<em&gt; M. leprae</em&gt; Ha infectado a un paciente. Un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) escribir es uno de esos métodos.

La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA)

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