Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

Finansieringen kom från NIH / NIAID bevilja RO1-AI-63.457 och Arra bevilja komplettera RO1-AI-63.457 S1. Vi erkänner bidragen från alla nuvarande och tidigare medlemmar av laboratoriet gruppen och medarbetare.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

Insamlingen av hud prover från spetälska patienter kräver kvalificerade läkare eller tekniker som arbetar på hudkliniker. Laboratorium personer som hanterar dessa prover måste ta stor omsorg att bära rockar, handskar och skyddsglasögon och att arbeta i en bio-säkerhetsbänk vid hantering av infekterade prover från människor eller bältdjur vävnad. Desinfektion av ytor och redskap är också kritisk. Att arbeta i en ren, steril biologiskt säkra skåp är viktigt för att undvika kontaminering av DNA-prover. DNA-extraktion har blivit relativt enkelt tack vare utvecklingen av utvinning kit från företag som Qiagen. Vägbeskrivning måste följas noggrant. Alla prover ska förvaras kallt när den inte används. Undvik upprepade, extrema temperaturväxlingar för prover. DNA primers som används i detta arbete kan beställas från olika företag som har citerats i listan över litteraturreferenser i slutet av detta dokument. Försiktighet bör vidtas för att arbeta med grundfärg i en DNA-fri miljö för att undvika kontaminering. Grundfärger kommer som torrt pulver och måste blandas med TE och spädas till en 100μM koncentration, separeras sedan i mindre mängder (Figur 2a). Fungerande lösningar av grundfärger spädas ytterligare till 10μM koncentrationer. Återigen, inte använda DNA-prover i områden / kåpor där primers används och förberedda. PCR-produkter bör också hållas kall när den inte används. En 3% agarosgel förberedelser kommer att ge bättre separation DNA-bandet, men tar längre tid att köra. För rent kvalitativa ändamål är 2% vanligen tillräcklig. Ethidiumbromidlösning används för färgning av DNA i agarosgeler är en mycket aktiv genotoxin som absorberas genom huden. Hantera denna lösning och geler färgas med den med stor försiktighet och alltid vara säker på att använda handskar. Tvätta händerna noggrant efter hantering av alla DNA-prover eller Ethidium material bromid. Kasta etidiumbromid färgningslösningen och tvätta och geler enligt institutionens riktlinjer. Geler är inte rutinmässigt krävs, detta steg kan elimineras när FLA metoder har inrättats. Det är dags och reagens tidskrävande. Den formamid lösning som används för att förbereda prover för FLA är också mycket giftigt och bör hanteras med försiktighet. Tvätta händerna efter dess användning. Kassera den följande institutionella riktlinjer. Läsa resultat från FLA med Peak Scanner programvara kan vara en utmaning. En grundläggande uppsättning av allel samtal (antal tandem repeats) har utvecklats vid CSU (tabellerna 4-7). (Det bör noteras att tabellerna 4-7 kanske inte är heltäckande. Liksom andra stammar av M. leprae studeras, kan alleler med antalet kopior utanför de uppräknade områden hittas.) En särskild utmaning innebär &quot;stammar&quot; toppar. Dessa familjer av toppar, särskilt STRs som bara omfattar 2-3 upprepar baspar, såsom (TA) 10. Ibland välja rätt topp för att läsa är svårt (Figur 7). I denna figur är toppen i den positiva kontrollen vid 190 bp de största topp. Peaks lägre i höjd som är 2, 4, eller till och med 6 par bas större eller mindre än de största toppen kallas &quot;stamma toppar.&quot; A-tailing kan också orsaka förvirring. A-tailing beskrivs tidigare i texten och i figur 8. Slutligen, om PCR-produkter förekommer rikligt i proverna, kanske toppar visas med en dubbel topp. I det här fallet, läs mitt i topp form. (Se figur 6, Patient 6.) Datahantering kan vara en stor uppgift för denna typ av arbete. Det är viktigt att registrera all relevant information för alla experiment som: datum för en uppgift eller procedur, operatör, band / platta kartor, FLA order, PCR-förhållanden och recept, datum för geler och fotografier, temperaturer lagring, DNA-spädningar mall, FLA elektronisk fil lagringsplatser etc. Bra organisation och hantering av data kan spara dig timmar av tid åt att leta efter specifik information i framtiden. Laborationerna beskrivs här har pågått i flera år på Colorado State University och på andra platser runt om i världen. Den stora bilden av vad alla insamlade data innebär och hur det kan vara för framtida bruk börjar växa fram. Figurerna 10A och 10B visar hur dessa DNA-fingeravtryck kan användas för att särskilja olika M. leprae stammar mellan länder (10A) eller till och mellan familjer (10B). Familjen och samhället kopplas fall har visat sig bära M. leprae av liknande eller identiska VNTR stam typer. Förhoppningen är att det kan vara möjligt att få ökad insikt i de (t) av spetälska överföring så att ett system för tidig upptäckt av överföringsnät kan utvecklas för dem MOSt vid risker och att kurativ läkemedelsbehandling kan inledas innan bestående neurologiska och dermatologiska skadan är skedd.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> DNeasy blod och vävnad Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69.504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR-Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206.143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Primers </td><td> Olika </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosgel </td><td> Olika </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x eller 6x Gel buffert </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recept finns att göra din egen * </td></tr><tr><td> Ethidiumbromidlösning </td><td> Olika </td><td></td><td> Späd från kon. </td></tr><tr><td> Hi-Di formamid lösning </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Utrustning </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> 2 Kylskåp </td><td> 4 ° C: 1 för DNA-prover, 1 för grundfärger och reagenser Multiplex </td></tr><tr><td> 1 mikrovågsugn </td><td> Eller lämpligt sätt för uppvärmning agaros och vatten för att göra geler </td></tr><tr><td> 1 autoklav </td><td> Eller tryckkokare för sterilisering av material </td></tr><tr><td> PCR-maskin </td><td> Termocykler </td></tr><tr><td> 2 uppsättningar pipetter </td><td> 0,5-10 l, 10-100 l, 20-200 l, 1000 l 1 set för grundfärg, 1 set för DNA </td></tr><tr><td> Submarine gelelektrofores rutan </td><td> Med formulär och kammar för att förbereda geler. </td></tr><tr><td> Elektrofores strömförsörjning </td><td> Med kablar för anslutning till gel rutan </td></tr><tr><td> Värmeblock </td><td> För Eppendorf-rör </td></tr><tr><td> Centrifugera </td><td> För Eppendorf rör / band </td></tr><tr><td> Kapillärelektrofores-system (genetisk analysator) </td><td> Eller tillgång till en institution som kan utföra denna analys </td></tr><tr><td> Plast </td><td> Disponibel aerosol pipettspetsar, Eppendorf rör, 8-brunnars remsor, plattor med 96 brunnar, några av optisk kvalitet </td></tr><tr><td> Dator med Internetuppkoppling </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

Studiet av överföring av spetälska är särskilt svårt eftersom smittämnen, leprae Mycobacterium inte kan odlas i laboratoriet. De enda källorna till bakterier är spetälska patienter, och experimentellt infekterade bältdjur och nakna möss. Således är många av de metoder som används i moderna epidemiologin är inte tillgängliga för studier av spetälska. Trots en omfattande global medicinsk behandling för spetälska som genomförs av WHO 1, förblir spetälska endemisk i många länder med ungefär 250.000 nya fall varje år. 2 Hela M. leprae arvsmassa har kartlagts 3,4 och många loci har identifierats som har upprepade delar av två eller flera baspar (kallas mikro-och minisatellites). 5 kliniska stammar av M. leprae kan variera i antal tandem upprepade segment (kort tandem repeats, STR) på många av dessa loci. 5,6,7 varierande antal tandem repetera (VNTR) 5 analys har använts för att särskilja olika stammar av spetälska baciller. Några av de loci verkar vara mer stabil än andra, visar mindre variation i upprepa siffror, medan andra tycks förändras snabbare, ibland i samma patient. Medan variationen av vissa VNTRs har tagit upp frågor om deras lämplighet för stamtypning 7,8,9, den framväxande data tyder på att analysera flera loci, som är olika i sin stabilitet, kan användas som en värdefull epidemiologisk verktyg. Flera locus VNTR analys (MLVA) 10 har använts för att studera spetälska evolution och transmission i flera länder inklusive Kina 11,12, Malawi 8, Filippinerna 10,13, och Brasilien 14. MLVA involverar flera steg. För det första är bakteriellt DNA tillsammans med värdvävnaden DNA från kliniska biopsier eller springa fläckar huden (SSS). 10 Önskad loci sedan förstärks från den extraherade DNA via polymeraskedjereaktion (PCR). Fluorescerande-märkta grundfärger för 4-5 olika loci används per reaktion, med 18 loci förstärks i totalt fyra reaktioner. 10 PCR-produkter kan utsättas för agarosgelelektrofores att verifiera närvaron av önskat DNA-segment, och sedan lämnades för lysrör fragment längd analys (FLA) med hjälp av kapillärelektrofores. DNA från bältdjur passerats bakterier med ett känt antal upprepa kopior för varje locus används som positiv kontroll. FLA kromatogram undersöks sedan med hjälp av Peak Scanner mjukvara och fragment längd omvandlas till antal VNTR kopior (allel). Slutligen är VNTR haplotyper analyserades för mönster, och i kombination med patientens kliniska data kan användas för att spåra distributionen av stam typer.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Spetälska, orsakad av<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Fortfarande är endemisk i många ställen. För att lära sig om spridning och läge för överföring av spetälska, är det viktigt att bestämma vilken stam av<em&gt; M. leprae</em&gt; Har smittat en patient. Variabel antal tandem repeats (VNTR) typning är en sådan metod.

DNA-fingeravtryck av Mycobacterium leprae Stammar genom olika Upprepa Antal Tandem (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Provberedning av<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakt för Nuclear Magnetic Resonance studier Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Tillväxt av Mycobacterium tuberculosis Biofilmer

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimerade protokoll för<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Draghantering: Fryst Stock Bevarande och underhåll i atymiska nakna möss

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstration av en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Skapandet av en tät Transposon införande bibliotek med bakteriell konjugation i Enterobacterial stammar som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analys av 18FDG PET/CT Imaging som ett verktyg för att studera Mycobacterium tuberculosis infektion och behandling i icke-mänskliga primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis hos möss med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...