Name: dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

Finansman NIH / NIAID hibe RO1-AI-63457 ve arra hibesine ek RO1-AI-63457 S1 tarafından sağlanmıştır. Biz laboratuvar grubu ve işbirlikçilerinin tüm mevcut ve geçmiş üyeleri katkıları kabul etmiş sayılırsınız.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes.">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li><li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus.">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leproma+Web+Server.">Leproma Web Server.</a> Leproma Web Server [Internet]. , (2004).</li><li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae.">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li><li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India.">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li><li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae.">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li><li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens.">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li><li>Weng, X. i. a. o. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China:+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study.">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li><li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County,+Yunnan,+China:+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation.">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li><li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu,+Philippines.">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li><li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients.">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li></ol>

Lepra hastalardan alınan deri örneklerinin toplanması cilt kliniklerinde çalışan yetenekli klinisyenler veya teknisyenler gerektirir. Bu örnekleri ele Laboratuar çalışanları, laboratuvar mont, eldiven ve koruyucu gözlük takın ve enfekte insan veya armadillo doku örnekleri ele alırken bir biyo-güvenlik kabini içinde çalışmak çok dikkat etmelidir. Dezenfeksiyon yüzeyler ve araçları da önemlidir. DNA örnekleri kirlenmesini önlemek için temiz, steril bir biyo-güvenli kabine çalışmak önemlidir. DNA ekstraksiyonu Qiagen gibi şirketlerden ekstraksiyon kitleri geliştirme sayesinde nispeten kolay hale gelmiştir. Yol dikkatle takip edilmelidir. Kullanılmadığı zaman Tüm numuneler soğuk tutulmalıdır. Örnekleri için tekrarlanan, aşırı sıcaklık değişimleri kaçının. Bu çalışmada kullanılan DNA primerleri Bu yazının sonunda literatür referansları listesinde atıf almıştır çeşitli şirketlerden sipariş edilebilir. Kontaminasyonu önlemek için primerler ile DNA özgür bir ortamda çalışması için önlemler alınmalıdır. Astarlar kuru toz olarak gelir ve TE ile karıştırılır ve bir 100μM konsantrasyona seyreltilmelidir, sonra da küçük miktarlarda (Şekil 2a) ayrılır . Astar Çalışma çözümleri 10μM konsantrasyonları daha seyreltilir. Yine, alanları / primerler kullanılır ve hazırlanan davlumbaz DNA örnekleri kullanmayın. PCR ürünleri kullanılmadığı zaman da soğuk muhafaza edilmelidir. % 3 agaroz jel hazırlanması daha iyi DNA bant ayrımı vermek, ama çalıştırmak için uzun sürer. Tamamen niteliksel amaçlar için,% 2 genellikle yeterlidir. Agaroz jel DNA boyama için kullanılan etidyum bromür çözüm son derece aktif genotoxin deri yoluyla emilir. Bu çözüm ve büyük bir özenle ve eldiven giymek için her zaman emin olmak boyanmış jeller taşıyınız. Herhangi bir DNA numune veya etidyum bromür malzemeleri dokunduktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Etidyum bromür boyama çözüm atın, kurumsal kurallarına göre yıkama ve jeller. Jeller rutin olarak gerekli değildir; FLA yöntemleri kurulduktan sonra bu adımı ortadan kaldırılabilir. Zaman ve reaktif alıcıdır. FLA için numune hazırlamada kullanılan formamid çözüm de son derece toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Kendi kullanımdan sonra ellerinizi yıkayınız. Kurumsal yönergeleri izleyerek atın. Tepe Tarayıcı yazılımı kullanarak FLA sonuçları okunması zor olabilir. Allel aramaları (tandem tekrarlar sayısı) bir temel set CSU (Tablo 4-7) geliştirilmiştir. (M. diğer suşları leprae çalışılmaktadır 4-7 Tablolar herşey dahil olmayabilir dikkat edilmelidir. Listelenen aralıkları dışında kopya sayıları ile allel olabilir.) Bir nevi meydan okumadır &#39;kekeme&#39; doruklarına içerir. Bu aileler, özellikle sadece böyle 10 (TA) 2-3 baz çifti tekrarlar içeren Şüpheli İşlem zirvelerinden. Bazen okumak için doğru tepe seçmek zordur (Şekil 7). Bu şekilde, 190 bp pozitif kontrol tepe ana zirve. 2 yüksekliği düşük Peaks, 4, hatta 6 baz çiftinden daha büyük veya daha küçük ana zirve &#39;kekeme doruklarına.&#39; Denir A-atık da karışıklığa neden olabilir. A-atık önceki metin ve Şekil 8&#39;de açıklanmıştır. Son olarak, PCR ürünlerinin örnekleri oldukça bol, zirveleri çift sivri görünebilir. Bu durumda, tepe formu merkezi okuyun. (Bkz: Şekil 6, Hasta 6 ) Veri yönetimi, bu tür çalışma için zorlu bir görev olabilir. Bir görev ya da işlem tarihinden, operatör, şerit / plaka haritalar, FLA siparişleri, PCR koşulları ve yemek tarifleri, jeller ve fotoğraflar tarihleri, depolama sıcaklıkları, DNA örneğinin dilüsyonları, FLA: tüm ilgili gibi tüm deneyler için bilgi kaydetmek için önemlidir. elektronik dosya depolama yerleri, vb İyi organizasyon ve veri yönetimi, gelecekte belirli bilgi parçaları için harcanan zaman saatlerce kaydedebilirsiniz. Burada açıklanan laboratuar çalışması, Colorado State Üniversitesi ve dünyadaki diğer yerlerde birkaç yıldır devam etmektedir. Toplanan verilerin her türlü vasıta ve ileride kullanmak nasıl olabilir ne büyük resim ortaya çıkmaya başlıyor. Şekiller 10A ve 10B bu DNA parmak izi farklı M. ayırt etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek ülkelerde (10A) ve hatta arasında aile (10B) leprae suşları arasında. Aile ve toplum bağlantılı durumlarda M. taşımak için gösterilmiştir. leprae benzer veya aynı VNTR zorlanma türleri. Umut iletim şebekeleri erken bir algılama sistemi, bu insanlar ecek için geliştirilmiş olabilir cüzam iletim modu (ler) böylece daha fazla fikir edinmek mümkün olabilir.t risk ve tedavi edici ilaç tedavisi, kalıcı nörolojik ve dermatolojik hasar yapılmadan önce başlayabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR seti </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Astarlar </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agaroz Jel </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x veya 6x Jel Yükleniyor Tampon </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Kendi * yapmak için kullanılabilir Tarifler </td></tr><tr><td> Ethidium Bromür çözümü </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Con ile seyreltilir. </td></tr><tr><td> Hi-Di Formamide Çözüm </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Tarama -500 Liz </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 2 Buzdolapları </td><td> 4 ° C: DNA örnekleri için 1, 1, astar ve Multiplex reaktifler </td></tr><tr><td> 1 adet mikrodalga fırın </td><td> Agaroz ve su jeller yapmak için ısıtma veya uygun bir şekilde </td></tr><tr><td> 1 otoklav </td><td> Malzemelerin sterilizasyon veya düdüklü tencere </td></tr><tr><td> PCR makinesi </td><td> PCR </td></tr><tr><td> 2 takım pipet </td><td> 0.5-10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, astarlar için 1000 ul 1 set, 1 set DNA </td></tr><tr><td> Denizaltı jel elektroforezi kutusu </td><td> Formlar hazırlanması jeller ve taraklar. </td></tr><tr><td> Elektroforez Güç kaynağı </td><td> Jel kutusu bağlantı kabloları ile </td></tr><tr><td> Isı blok </td><td> Eppendorf tüpleri için </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf tüpleri / şeritler için </td></tr><tr><td> Kapiler elektroforez sistemi (genetik analizör) </td><td> Veya bu analiz, bir kurumun erişim </td></tr><tr><td> Plastik </td><td> Tek kullanımlık aerosol pipet uçları, Eppendorf tüpleri, 8-iyi şeritler, 96-iyi plakaları, optik kalitesi </td></tr><tr><td> İnternet bağlantısı olan bilgisayar </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

Cüzam iletim çalışma etkeni bu yana, Mycobacterium leprae, laboratuvar ortamında kültüre edemez özellikle zordur . Bakteriler tek kaynakları cüzzam hastaları ve deneysel olarak enfekte armadillos ve çıplak farelerin. Böylece, modern epidemiyolojisi kullanılan yöntemlerden birçok cüzam çalışma mevcut değildir. Lepra için DSÖ 1 tarafından uygulanan kapsamlı bir küresel uyuşturucu tedavi programına rağmen, cüzzam, yaklaşık 250.000 yeni vaka, her yıl pek çok ülkede endemik olarak kalır. 2 tüm M. leprae (mikro-ve minisatellites olarak da adlandırılır) genom 3,4 eşlenen olmuştur ve birçok lokusların 2 veya daha fazla baz çiftinden segmentleri tekrarlanan olduğu tespit edilmiştir. M. 5 Klinik suşları leprae bu lokuslar birçok tandem tekrarlanan segmentlerinin sayısı (kısa tandem tekrarlar, STR) değişebilir. 5,6,7 Değişken numarası tandem repeat (VNTR) 5 analizi, cüzzam basilinin farklı suşları ayırt etmek için kullanılır olmuştur . Lokusların bazıları diğerlerine göre daha istikrarlı, diğerleri aynı hasta, bazen daha hızlı bir şekilde değiştirmek gibi görünüyor ise, tekrar sayısı daha az varyasyon gösteren görünür. Belirli VNTRs değişkenliği gerginlik yazarak 7,8,9 için uygunluğuna ilişkin sorular getirdi, ortaya çıkan veriler, istikrar içinde farklı birden fazla lokusların, analiz etmek, değerli bir epidemiyolojik araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Birden fazla lokus VNTR analizi (MLVA) 10 Çin 11,12, Malavi 8, Filipinler 10,13, 14 ve Brezilya da dahil olmak üzere birçok ülkede cüzzam evrim ve iletim incelemek için kullanılır olmuştur. MLVA birden fazla adım içerir. İlk olarak, bakteriyel DNA klinik biyopsilerin veya yarık cilt smear (SSS) konak doku DNA ile birlikte ayıklanır 10 istenilen lokusların sonra çıkarılan DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile güçlendirilir. 4-5 farklı lokusların için floresan etiketli primerler sonra istenen DNA segmentleri varlığını doğrulamak için 10 PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi tabi olabilir. Dört reaksiyon toplam 18 lokusların amplifiye olan, reaksiyon başına kullanılan ve kapiller elektroforez kullanarak floresan parçası uzunluğu analizi (FLA) için sunulmuştur. Armadillo gelen DNA pozitif bir kontrol olarak kullanılan her bir lokus için tekrar kopya sayısı ile bilinen bir bakteri geçişli. FLA kromatogramlar sonra Tepe Tarayıcı yazılımı ve parça uzunluğu VNTR kopya (alleli) sayısı dönüştürülür kullanılarak incelenmektedir. Son olarak, VNTR haplotipleri kalıpları için analiz edilir ve hastanın klinik veriler ile bir araya geldiğinde gerginlik türlerinin dağılımını izlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA at JoVE.com

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Neden Lepra<emLeprae&gt; Mycobacterium</em&gt;, Birçok yerde hala endemiktir. Yayılması ve cüzam iletim modu hakkında bilgi edinmek için, bunu belirlemek için önemlidir suşu<em&gt; M. leprae</em&gt; Bir hasta enfekte. Değişken sayıda tandem tekrarlar (VNTR) yazarak, böyle bir yöntem.

DNA parmak izi<emLeprae> Mycobacterium</emFragment Lenght Analizi (FLA) - Değişken Numarası Tandem Repeat (VNTR)> Suşlarının

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Için optimize Protokoller<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gerilme Yönetimi: Atimik Çıplak Farelerde Dondurulmuş Hazır Koruma ve Bakım

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

DNA parmak izi Mycobacterium Suşlarının