Name: transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00
Duration: 10 min 24 s
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在这个手稿中描述的工作成为可能，资金从美国加州再生医学研究所（CIRM）UCR干细胞核心。

我们的协议，开始与人类iPSCs的方法，以适应无饲养层培养，GeneJuice（EMD）和人类iPSCs使用Amaxa公司nuclefector设备的核转染转染人类iPSCs的协议。 注：下列程序进行，在无菌层流罩。所有的媒体和解决方案是平衡至37℃或室温，然后再启动，除非另有规定。 1。馈线系统上建立人类iPSCs 人类iPSCs可以保持原来的饲养层细胞分裂，转移到Geltrex涂层的菜和维护馈线转染前两个通道。 <ol><li>在4°C过夜解冻Geltrex要准备Geltrex涂料，冷DMEM的解冻Geltrex 1:50稀释。混合轻轻的解决方案。 </li></ol>注：Geltrex，类似基底膜是可溶形式的基底膜MATR九纯化Engelbreth - 霍尔姆群（EHS）从小鼠肿瘤细胞。或者，基底膜可以用作一种细胞外基质，建立人类无馈线IPSC的文化。 <ol start="2"><li>覆盖培养孔与Geltrex溶液（1毫升，35毫米）的整个表面上。外套井Geltrex在37℃培养箱中培养1小时。 </li><li>要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。 </li></ol>要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。 <ol start="4"><li>将添加10-15玻璃珠的细胞，轻轻地旋转板。加入2毫升的淘汰赛DMEM / F12，轻轻捣碎。细胞悬浮液转移到10毫升离心管中。 </li><li>附带细胞以800rpm的转速在室温下3分钟。 </li><li>吸液管从上清液，留下人类IPSC的颗粒完好无损。轻轻一抖管，分散细胞沉淀。 </li><li>从涂好删除Geltrex。 </li><li>轻轻重悬人类IPSC的颗粒在适当体积的STEMPRO。分发井间的进料器，取决于增殖率）。人类iPS细胞可以传代的分路比为1:2到1:6。 </li><li>小心地放入5％CO 2培养箱中，涡流板仔细横跨孔中的细胞，以确保均匀分布。 </li><li>饲料，直到细胞的细胞每天都准备好再次被分裂（当细胞达到80％融合）。 </li><li>流路到新的Geltrex涂覆以及人类iPSCs（步骤1.3到1.9）中的分流比为1:2。小菌落形成上Geltrex转染前涂好且分布均匀。 </li></ol> 2。 GeneJuice转染的人类iPSCs 细胞（6孔板上生长）应该是约40 -50％汇合的转染当天，以达到最佳的转染效率。这是没有必要改变的细胞培养基中，直到第二天。 <ol><li>准备的100微升KO-DMEM/F12在无菌的1.5毫升微量离心管。加入27微升GeneJuice转染试剂。拌匀。在室温下孵育5分钟。 </li><li>加入4μg质粒DNA。管，在室温下孵育15分钟。质粒的选择是至关重要的最佳的转染效率。我们使用的质粒与CAG启动子5（pCAG-eGFP的）驱动的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。 CAG启动子是一个强启动子的转录活性在人类iPSCs，并因此可以被用来驱动在这些细胞中的转基因表达。在我们的手中，线性化的质粒转染效率似乎并没有影响。 </li><li>加入GeneJuice-DNA混合物的细胞和旋流板。旋转板，在1200 rpm离心5分钟（&#39;spinoculation&#39;方法），以增加接触就做好了人类iPSCs转染混合物。 </li><li>培养细胞在37及度C过夜。 </li><li>监测转染效率的第二天。 </li><li>对于稳定转染，改变介质的第二天与新鲜STEMPRO。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。 </li></ol> 3。核转染的人类iPSCs 馈线或Geltrex上生长的人类iPSCs可以使用核转染。然而，我们强烈建议replating，nucleofected人类iPSCs到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），人包皮成纤维细胞（HFF）馈线，以确保高细胞活力和恢复。应使用至少2百万个细胞，以实现更高的后核转染的细胞的存活。 <ol><li>准备饲养层细胞的条件培养基（CM）培育人类iPSC的Knockout血清的更换（KOSR）的媒体与饲养层细胞过夜。收集CM，每24小时。 </li></ol>注：任何用于制备饲养层（如BLK6，CF1和MF1）的小鼠品系是适合用于R在CM。 <ol start="2"><li>核转染的当天，预治疗人类iPSCs用10μMROCK抑制剂至少为1小时。 </li><li>准备人类干细胞nucleofector溶液的82μl的在无菌的1.5毫升微量离心管中。加入18微升补充1。拌匀。溶液在37℃下孵育5分钟。 </li><li>预温暖的饲养细胞的条件培养基（CM）和0.25％胰蛋白酶/ EDTA至37℃。引擎盖下，prelabel 1无菌15毫升锥形管。 </li><li>小心地取出媒体从人类iPSC的文化被nucleofected。轻轻洗2毫升1X磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，每孔细胞。吸取PBS。 0.25％胰蛋白酶，每孔加入1 ml。细胞在37℃下孵育3分钟。 </li><li>细胞用1000毫升移液管尖轻轻捣碎。洗井的底部，以确保所有人类iPSCs完全脱离。细胞悬浮液转移到标记的15毫升锥形管。 </li></ol>注：胰酶消化成单个C英语学习者应严格避免。细胞应该只被抛下小由约三胞胎细胞组成的细胞团块，。在随后的处理的细胞小的细胞团块（小区三元组），将解离成单细胞。 <ol start="7"><li>加9毫升的MEF媒体灭活胰蛋白酶。附带细胞以800rpm，3分钟。小心吸出上清液，并留下细胞沉淀完好。 </li><li>重悬细胞预热100μl的人干细胞nucleofector的解决方案，从步骤3.3。 </li><li>将细胞转移到一个nucleofector的比色皿，用1毫升移液管尖端部。 </li><li>到试管中的细胞悬浮液中加入4μg质粒DNA。细胞和DNA混合，轻轻回荡。轻按两次比色皿的引擎盖上表面。 </li><li>将试管中到nucleofector持有人。方案B-016。 Nucleofect细胞按按钮X. </li></ol> &lt; <ok> &gt;时，将显示的核转染过程是COMPLET的ED（通常只需要1-5秒）。使用其他核转染方案的（A-023，A-033和U-023），得到小于10％的从​​人类iPSCs的eGFP阳性细胞。 </ok><ol start="12"><li>从试管中使用所提供的巴斯德塑料吸管检索nucleofected细胞。恢复细胞，再悬浮到无菌的1.5毫升微量离心管中预热的CM和ROCK抑制剂。 10分钟，在37°C培养细胞，让细胞恢复。 </li><li>逐滴传递细胞的饲养层上使用1毫升的移液枪枪头。孵育细胞于37℃培养过夜。 </li><li>监测转染效率的第二天。为了获得稳定的转基因人类iPSCs克隆稳定表达的转基因，改变介质的第二天，CM和ROCK抑制剂。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。 </li></ol> 4。代表性的成果： <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <st荣图1。的RIV1人类iPSCs与pCAG-EGFP转染的显微照片。 （A）-EGFP表达RIV1细胞转染使用GeneJuice在Geltrex转染后12小时。电镀和馈线后，核转染（B）B-016和A-023（C）程序上形成的RIV1人类iPSCs的殖民地。 （D）稳定EGFP表达人类iPSC的殖民地无处不在的绿色荧光蛋白表达来自GeneJuice。 （E）稳定转染RIV1人的iPS细胞保留构的绿色荧光蛋白表达在胚体分化。

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	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

我们的协议简单，可靠，重现性好技术引进转基因人类iPSCs没有显着的毒性作用和细胞死亡。人类iPSCs应成更小的细胞团块，（5-10个细胞）传代，并镀上Geltrex在高密度（1:2），以确保最佳的转染效率在众多的小菌落。对于人类IPSC的线更容易发生分化和细胞死亡，更高数量的人类iPSCs（最多至4×10 6个细胞），应使用一个单一的核转染实验。瞬时转染1天之内产生大量的转基因表达人类iPSCs。稳定转染的iPSC的克隆通常出现在7天，应该是在三个星期内随时可以拿起这些转基因的殖民地。这里所描述的CAG启动子的使用确保无处不在表达绿色荧光蛋白记者。在这样的改善，我们的协议可以被输入到其他应用程序，包括过度表达，Conditional归纳，推导系特异性记者，短发夹RNA，siRNA敲除，基因打靶技术和同源重组。

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> 0.25％胰蛋白酶与EDTA </td><td> Invitrogen公司</td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 巯基乙醇</td><td> Invitrogen公司</td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3毫米的玻璃珠</td><td> Fisher Scientific则</td><td> 11-312A </td><td>玻璃珠应用盐酸（HCl）过夜，用氢氧化钠（NaOH）和蒸馏水冲洗掉，并在使用前用高压灭菌器灭菌。 </td></tr><tr><td> Accutase细胞分离试剂</td><td> Invitrogen公司</td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） </td><td> Invitrogen公司</td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM（高糖） </td&gt; <td>龙沙</td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清的</td><td> Invitrogen公司</td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> Invitrogen公司</td><td> 12760013 </td><td>生长因子减少</td></tr><tr><td> GeneJuice转染试剂</td><td> EMD Biosciences公司</td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I（100X） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 35050061 </td><td> L-谷氨酰胺（Invitrogen公司，25030081）也可以被代替使用。 </td></tr><tr><td>人类iPSC的KOSR媒体</td><td></td><td></td><td> 500毫升人ES媒体由390毫升基因敲除的DMEM / F12，100毫升Knockout血清替代品，将5ml Glutamax-I（100X），5毫升的NEAA（100X），500微升，2 - 巯基乙醇（55毫米），用10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和补充。 </td></tr><tr><td>淘汰赛DMEM/F12 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>Knockout血清替代品（KOSR） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞介质</td><td></td><td></td><td> MEF媒体包括90％FBS，1×NEAA Glutamax-I，1X和1X丙酮酸钠的DMEM（高糖） </td></tr><tr><td>非必需氨基酸，NEAA（100X） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td>人类干的细胞nucleofector解决方案与补充</td><td>龙沙</td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，不含Ca 2 +和Mg 2 + </td><td> Invitrogen公司</td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100X） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO介质工具包</td><td> Invitrogen公司</td><td> A1000701 </td><td> 500毫升STEMPRO媒体组成的454毫升敲满分的DMEM / F12，10毫升STEMPRO无血清生长添加物（50X），5毫升Glutamax-I（100X），将5ml NEAA（100X），36毫升BSA（牛血清白蛋白，25％），909微升2 - 巯基乙醇（55MM用10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子）和补充。 </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

转基因（GM）将继续是一个重要的工具，在研究干细胞生物学和提出潜在的临床应用人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）1。尽管仍有改进的在几个基因传递方法已被描述2-9，转染仍然是一个反复无常的过程对人类胚胎干细胞，尚未据报道，在人类诱导多能干细胞（iPSCs）。在这段视频中，我们展示了我们的实验室常规转染和利用质粒增强型绿色荧光蛋白（EGFP）记者nucleofects人类iPSCs。人类iPS细胞无饲养层培养适应和维护，以消除可能的饲养细胞转染，并允许稳定的转基因IPSC的克隆，转染后的有效选择。对于核转染，人类iPSCs预先处理与ROCK抑制剂11，胰蛋白酶消化成小的细胞团块，上馈线nucleofected和再接种在饲养细胞空调中，增强细胞恢复。 6小时后，可以得到转基因表达的人类iPSCs。抗生素的选择被施加后24小时和稳定的转基因品系1星期内出现。本协议的鲁棒性和重现性好，可用于人类iPSC的线，在不改变这些细胞的多能性。

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

尽管基因改造的最新进展，转染的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）保持一个反复无常的过程。据我们所知，系统和有效的方法，转染人诱导多能干细胞（iPSCs）尚未见报道。在这里，我们描述了可靠的协议，有效地转染和nucleofect人类iPSCs。

人类诱导多能干细胞的转染和Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

人类神经干细胞转染与Amaxa Nucleofector

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科研

生物学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

由Stemgent人类TF慢病毒重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

选择和隔离殖民地的人类诱导多能干细胞重新编程成年成纤维细胞

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

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In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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