Name: transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

העבודה מתוארת בכתב היד הזה התאפשר הודות למימון ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (CIRM) לליבת תאי גזע UCR.

הפרוטוקול שלנו מתחיל בשיטה להתאים iPSCs אדם לתרבויות נטולות מזין, ואחרי פרוטוקולים לtransfecting iPSCs אדם באמצעות GeneJuice וnucleofection של iPSCs אדם באמצעות מכשיר nuclefector AMAXA (EMD). הערה: ההליכים הבאים יבוצעו בברדס זרימה למינרית סטרילי. כל כלי התקשורת והפתרונים הם מתאזנת עד 37 ° C או טמפרטורת חדר לפני התחילה אלא אם צוין אחר. 1. הקמת iPSCs אדם במערכת מזין חינם iPSCs אדם נשמר בעבר בתאים מזינים ניתן לפצל, מועבר על גבי צלחת Geltrex מצופית ונשמר במשך שתי פסקאות לפני transfection מזין חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר Geltrex הלילה ב 4 ° C. כדי להכין את ציפוי Geltrex, לדלל להפשיר Geltrex 1:50 בDMEM הקר. מערבב בעדינות את הפתרונים. </li></ol> הערה: Geltrex, כמו Matrigel היא צורה מסיסה של matr קרום המרתףix מטוהר מעכברי Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) תאים סרטניים. לחלופין, Matrigel יכול לשמש כמטריצה ​​להקים תרבויות iPSC אדם מזין חינם. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את כל פני השטח של בארות תרבות עם Geltrex פתרון (1 מ&quot;ל ל35-מ&quot;מ היטב). מעייל עם בארות Geltrex על 37 מעלות צלזיוס חממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ&quot;ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק. </li></ol> לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ&quot;ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10-15 חרוזי זכוכית לתאים ועדינות עיטורי הצלחת. הוסף 2 מ&quot;ל של נוקאאוט DMEM / F12 ועדינות triturate. העברת השעית תא לצינור צנטריפוגה 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב800 סל&quot;ד ל3 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מהצינור, ומשאיר אדם iPSC גלולה ללא פגע. עדינות קפיצית לצינורלפזר תא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Geltrex מהבאר המצופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend iPSC גלולה אנושית עדינות בנפח מתאים של STEMPRO. להפיץ בין בארות של מתקני האכלה, תלוי בשיעור ההפצה). iPSCs אדם ניתן passaged ביחס פיצול של 1:02-01:06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מקום לCO 2 חממה 5%, מערבולת הצלחת בקפידה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים ברחבי הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזנה יומיים עד תאים מוכנים לנפרד שוב (כאשר תאים להגיע 80% confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs Passage אדם על כן Geltrex המצופה חדש (שלב 1.3-1.9) בביחס פיצול של 1:2. מושבות קטנות צריכות להיוצר ומתחלקות באופן שווה על מצופה Geltrex היטב לפני transfection. </li></ol> 2. Transfection של iPSCs אדם עם GeneJuice תאים (גדל על צלחות 6-כן) צריכים להיות כ -40% -50 confluent ביום transfection כדי להשיג יעילות transfection אופטימלית. זהאין צורך לשנות את המדיום הסלולרי עד ליום המחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 KO-DMEM/F12 μl בצינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל אפנדורף. הוסף מגיב transfection GeneJuice μl 27. מערבב היטב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 DNA פלסמיד מיקרוגרם. דגירת הצינור בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. הבחירה של פלסמיד היא קריטית ליעילות transfection אופטימלית. אנו משתמשים בפלסמיד עם חלבון משופר ירוק פלואורסצנטי (eGFP) מונע על ידי אמרגן CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG אמרגן הוא אמרגן חזק שהוא תעתיק פעיל בiPSCs אדם ולכן ניתן להשתמש בכונן ביטוי transgene בתאים אלה. בידות שלנו, linearization של פלסמיד לא נראה להשפיע על יעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תערובת GeneJuice-DNA לתאים וקרונות הצלחת. ספין הצלחת ב 1200 סל&quot;ד במשך 5 דקות (השיטה &#39;spinoculation&#39;) כדי להגדיל את הקשר של תערובת transfection עם iPSCs אדם על הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 &amp;מעלות; C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על יעילות transfection למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfection היציב, לשנות בינוני למחרת עם STEMPRO טרי. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות. </li></ol> 3. Nucleofection של iPSCs אדם iPSCs אדם גדל על מתקני האכלה או Geltrex יכול לשמש לnucleofection. עם זאת, אנו ממליצים בחום replating iPSCs האדם nucleofected על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) או פיברובלסטים עורלה אנושיים (HFF) ניזונים כדי להבטיח כדאיויות תא גבוהות והתאוששות. לפחות 2 מיליון תאים יש להשתמש כדי להשיג הישרדות תא גבוהה יותר בעקבות nucleofection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת הממוזגת מזין תאים (CM) על ידי דוגר נוקאאוט iPSC אדם החלפת מדיה סרום (KOSR) עם תאים מזינים בן לילה. איסוף CM כל 24 שעות. </li></ol> הערה: כל עכבר זן המשמש להכנת שכבות מזינות (כגון BLK6, CF1 וMF1) מתאימה לשימוש for עושה סי. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום nucleofection, טרום לטפל iPSCs אדם עם מעכב ROCK מיקרומטר 10 לפחות שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 82 μl של פתרון nucleofector תאי גזע אנושי בצינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל אפנדורף. הוסף תוסף 1 18 μl. מערבב היטב. דגירת פתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת מזין מראש חם תא ממוזג (CM) ו0.25% טריפסין / EDTA עד 37 ° C. מתחת למכסה המנוע, prelabel צינור אחד סטרילי 15 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות מתקשורת תרבות iPSC האנושית להיות nucleofected. לשטוף בעדינות את התאים עם פתרון 2 מ&quot;ל 1X פוספט שנאגר (PBS) לטוב. לשאוב PBS. הוסף 1 מ&quot;ל של טריפסין 0.25% לטובים. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות triturate התאים עם טיפ 1000 מ&quot;ל פיפטה. שטוף את תחתית הבאר כדי לוודא שכל iPSCs האדם מנותק לגמרי. העברת השעית תא לצינור כותרתו 15 מיליליטר חרוטים. </li></ol> הערה: לאחת Trypsinization גאמות בהחלט יש להימנע. תאים צריכים לעזוב רק לתוך גושים קטנים של תאים, מונה כשלישייה של תאים. גושים קטנים של תאים (תאי לשות) יהיו ניתקו לתוך תאים בודדים בטיפול הבא של התאים. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל MEF תקשורת להשבית טריפסין. ספין תאים ב800 סל&quot;ד במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ולהשאיר גלולת התא שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב100 μl prewarmed של פתרון אנושי מתאי הגזע nucleofector שלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לקובט nucleofector באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך השעית התא בקובט. מערבב תאים ו-DNA על ידי מתערבל עדין. קש קובט פעמים על פני שטח מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט לתוך מחזיק nucleofector. השתמש בתוכניות B-016. תאי Nucleofect על ידי לחיצה על הכפתור X. </li></ol> &lt; <ok> &gt; יוצג בעת תהליך nucleofection הוא completאד (בדרך כלל לוקח 1-5 שניות בלבד). השימוש בתוכניות nucleofection אחרות (-023, ו-U-033-023) הניב פחות מ 10% מתאים eGFP חיוביים מiPSCs אדם. </ok><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחזרו תאי nucleofected מקובט באמצעות פיפטה ספקה פסטר הפלסטיק. שחזור תאים על ידי resuspending בסנטימטר prewarmed ומעכב ROCK לתוך צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל אפנדורף. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר תאים להתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי העברה-חכמים שחרר אל שכבות מזין באמצעות טיפ 1 מ&quot;ל פיפטה. דגירת התאים ב 37 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על יעילות transfection למחרת. לגזור שיבוטים יציבים של iPSCs אדם המהונדס שיציבות להביע transgene, לשנות בינוני למחרת עם CM ומעכב ROCK. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <strong&gt; איור 1. Photomicrographs של Riv1 iPSCs האדם transfected עם pCAG-eGFP. () EGFP-להביע Riv1 תאי transfected באמצעות GeneJuice על Geltrex 12 שעות שלאחר transfection. מושבות של Riv1 iPSCs אדם מצופות ונוצרו על מתקני ההאכלה הבאות nucleofection באמצעות B-016 (ב) ו-023 (ג) תכנית. (ד &#39;) ביציבות מושבות eGFP מבטאים-אדם iPSC עם ביטוי eGFP כל מקום נגזרו מGeneJuice. (ה) Riv1 iPSCs אדם יציבות-transfected שמר ביטוי eGFP מכונן במהלך בידול הגוף embryoid.

<ol>
	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תוצאת פרוטוקולינו בטכניקות פשוטות, חזקות ולשעתק מאוד להציג transgenes לiPSCs אדם ללא השפעה רעילה בולטת ומוות של תאים. iPSCs אדם צריך להיות passaged לתוך גושים קטנים יותר של תאים (תאים 5-10) ומצופה על Geltrex בצפיפות גבוהה (1:2) על מנת להבטיח יעילות אופטימלית transfection במושבות קטנות רבות. לקווי iPSC אדם שנוטים יותר למות בידול ותא, מספר גבוה יותר של iPSCs אדם (עד 4 X 10 6 תאים) אמור לשמש לניסוי nucleofection אחת. assay transfection חלוף יוצר מספר גדול של transgene-לבטא iPSCs אדם ביום 1. שיבוטי iPSC transfected ביציבות בדרך כלל מופיעים בתוך 7 ימים, והמושבות המהונדסות האלה צריכות להיות מוכנות שיבואו לקחת בתוך שלושה שבועות. השימוש במקדם CAG מתואר כאן מבטיח ביטוי בכל מקום בכתב eGFP. תחת שיפורים כאלה, הפרוטוקולים שלנו יכולים להיות מוזנים לתוך יישומים אחרים, כולל ביטוי יתר, גאינדוקצית onditional, גזירה של קווי שושלת ספציפיים כתב, shRNA או מציאת siRNA, גן המיקוד ורקומבינציה ההומולוגית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טריפסין 0.25% עם EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3 חרוזי זכוכית מ&quot;מ </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 11-312A </td><td> חרוזי זכוכית יש לשטוף עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בלילה, שטפה עם נתרן הידרוקסידי (NaOH) ומים מזוקקים, ומעקרים על ידי חיטוי לפני השימוש. </td></tr><tr><td> מגיב דיסוציאציה תא Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td> גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (רמת סוכר גבוה) </td&gt; <td> Lonza </td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> Invitrogen </td><td> 12760013 </td><td> גורם גדילה מופחתת </td></tr><tr><td> מגיב transfection GeneJuice </td><td> EMD Biosciences </td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-(100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td> L-גלוטמין (Invitrogen, 25030081) יכול לשמש גם במקום. </td></tr><tr><td> iPSC אדם KOSR תקשורת </td><td></td><td></td><td> 500 מיליליטר האדם ES תקשורת מורכבת של 390 המ&quot;ל DMEM נוקאאוט / F12, Replacer הסרום נוקאאוט 100 מ&quot;ל, 5 מיליליטר Glutamax-(100X), NEAA 5 מ&quot;ל (100X), 500 μl 2-Mercaptoethanol (55mm) והשלימה עם 10 ng / ml bFGF . </td></tr><tr><td> נוקאאוט DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KOSR) </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> תקשורת פיברובלסטים העוברי של עכבר </td><td></td><td></td><td> MEF התקשורת מכילה 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I ו-פירובט נתרן 1X בDMEM (רמת סוכר גבוה) </td></tr><tr><td> חומצת אמינו חיוני שאינן, NEAA? (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון אנושי בתאי גזע nucleofector 1 עם תוספת </td><td> Lonza </td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט נאגר מלוח ללא Ca 2 + וMg 2 + </td><td> Invitrogen </td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO הבינוני ערכה </td><td> Invitrogen </td><td> A1000701 </td><td> 500 מ&quot;ל STEMPRO תקשורת מורכבת מנוק המ&quot;ל 454מתוך DMEM / F12, 10 מיליליטר תוסף STEMPRO סרום ללא צמיחה (50x), 5 מ&quot;ל Glutamax-(100X), 5 מ&quot;ל NEAA (100X), 36 המ&quot;ל BSA (שור אלבומין, 25%), 909 μl 2-Mercaptoethanol (55mm ) והשלים עם 10 ng / ml bFGF. </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

שינוי גנטי ממשיך להיות כלי חיוני בלימוד ביולוגיה של תאי גזע וביישומים קליניים המפרט פוטנציאליים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) 1. למרות השיפור במספר שיטות מסירת גן תואר 2-9, transfection נותר תהליך קפריזי לhESCs, ועדיין לא דווח בתאים אנושיים מושרים pluripotent גזע (iPSCs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים איך המעבדה שלנו באופן שגרתי וtransfects nucleofects iPSCs אדם באמצעות פלסמיד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (eGFP). iPSCs אדם מותאם ומתוחזק כתרבויות מזין חינם כדי לשלול את האפשרות של transfection תא מזין ויעילה המאפשרת בחירה של שיבוטי iPSC מהונדסים יציבים לאחר transfection. לnucleofection, iPSCs אדם מראש שטופל במעכבי רוק 11, trypsinized לתוך גושים קטנים של תאים, וnucleofected replated על מתקני האכלה במזין תא ממוזגבינוני כדי לשפר את התאוששות תא. iPSCs האדם transgene מבטא-ניתן לקבל לאחר 6 שעות. בחירת אנטיביוטיקה חלה לאחר 24 שעות וקווים הטרנסגניים יציבים מופיעות בתוך השבוע 1. הפרוטוקול שלנו הוא חזק ולשעתק לקווי iPSC אדם מבלי לשנות pluripotency של תאים אלה.

Watch this Scientific Journal Video about Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...