Name: transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00
Duration: 10 min 24 s
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Trabalho descrito neste manuscrito foi possível graças ao financiamento do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM), para UCR Núcleo Stem Cell.

Nosso protocolo começa com um método para se adaptar iPSCs humanos a culturas alimentador livres, seguida de protocolos para a transfecção de iPSCs humanos usando GeneJuice (EMD) e nucleofection de iPSCs humanos usando um dispositivo AMAXA nuclefector. Nota: Os seguintes procedimentos são realizados numa chaminé de fluxo laminar estéril. Todos os meios e soluções são equilibradas a 37 ° C ou à temperatura ambiente antes de iniciar a menos que especificado de outra forma. 1. Estabelecer iPSCs humanos no alimentador-livres IPSCs humanos previamente mantidos em células alimentadoras podem ser divididos e transferidos para Geltrex revestido prato e mantida por duas passagens antes do alimentador sem transfecção. <ol><li> Descongelar Geltrex durante a noite a 4 ° C. Para preparar o revestimento Geltrex, diluir descongelado Geltrex 1:50 em DMEM frio. Misturar as soluções suavemente. </li></ol> Nota: Geltrex, como Matrigel é uma forma solúvel de MATR membrana basalix purificadas a partir de murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células tumorais. Alternativamente, Matrigel pode ser usado como uma matriz extracelular de estabelecer alimentador sem culturas humanas IPSC. <ol start="2"><li> Cobrir a totalidade da superfície dos poços de cultura com Geltrex solução (1 ml para um poço de 35 mm). Casaco poços com Geltrex a 37 ° C durante 1 hora incubadora. </li><li> Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar. </li></ol> Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar. <ol start="4"><li> Adicionar 10-15 pérolas de vidro para as células e agitar suavemente a placa. Adicionar 2 ml de DMEM KnockOut / F12 e triturar suavemente. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 10 ml. </li><li> Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante dos tubos, deixando humano iPSC pellet intacto. Agite suavemente o tubo paradispersar pellet celular. </li><li> Remover Geltrex do poço revestido. </li><li> Gentilmente ressuspender o pellet em iPSC humano num volume apropriado de STEMPRO. Distribuir entre os poços de alimentadores, dependendo da taxa de proliferação celular). IPSCs humanos podem ser passadas em uma razão de divisão de 1:2 a 1:6. </li><li> Cuidadosamente lugar em 5% CO 2 incubadora, redemoinho a placa cuidadosamente para assegurar uma distribuição uniforme de células em poços. </li><li> Células de alimentação diários até que as células estão prontas para ser dividido de novo (quando as células atingem a confluência de 80%). </li><li> IPSCs passagem em humanos bem novo Geltrex revestido (passo 1,3-1,9) em uma razão de divisão de 1:2. Colónias pequenas devem ser formados e distribuídos uniformemente sobre Geltrex revestido bem antes da transfecção. </li></ol> 2. A transfecção de iPSCs humanos com GeneJuice As células (cultivadas em placas de 6 poços), devem ser, aproximadamente, 40 a 50% confluentes no dia da transfecção para atingir a eficiência de transfecção óptima. Énão é necessário mudar o meio da célula até ao dia seguinte. <ol><li> Preparar 100 uL KO-DMEM/F12 em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 27 ul de reagente de transfecção GeneJuice. Misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Adicionar 4 ug de ADN do plasmídeo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 minutos. A escolha do plasmídeo é crítico para a eficiência de transfecção óptima. Usamos um plasmídeo com uma proteína de fluorescência verde melhorada (eGFP) conduzido por promotor CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG promotor é um promotor forte que é transcripcionalmente activo em iPSCs humanos e, assim, pode ser utilizado para dirigir a expressão do transgene em tais células. Em nossas mãos, linearização de plasmídeo não parecem afetar a eficiência de transfecção. </li><li> Adicionar GeneJuice DNA-mistura para as células e redemoinho da placa. Girar a placa a 1200 rpm durante 5 minutos (método de &#39;spinoculation&#39;), para aumentar o contacto da mistura de transfecção com iPSCs humanas sobre o poço. </li><li> Incubar as células a 37 &amp;deg; C durante a noite. </li><li> Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte. </li><li> Para transfecção estável, alterar médio no dia seguinte com STEMPRO fresco. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas. </li></ol> 3. Nucleofection de iPSCs humanos IPSCs humanos cultivados em alimentadores ou Geltrex pode ser usado para nucleofection. No entanto, recomendamos repique nucleofected iPSCs humanos para os fibroblastos embrionário (MEF) ou fibroblastos prepúcio humano (HFF) alimentadores para garantir a viabilidade das células de alta e recuperação. Pelo menos 2 milhões de células deve ser utilizado para alcançar a sobrevivência celular após mais nucleofection. <ol><li> Prepare alimentador de células-meio condicionado (MC), incubando KnockOut iPSC soro humano de reposição (KOSR) meio com células alimentadoras durante a noite. Colete CM a cada 24 horas. </li></ol> Nota: Qualquer estirpe de ratinho utilizada para a preparação de camadas alimentadoras (como BLK6, CF1 e MF1) é adequado para ser usado for tornando CM. <ol start="2"><li> No dia da nucleofection, pré-tratamento de humanos com 10 iPSCs inibidor ROCHA uM durante pelo menos 1 hora. </li><li> Preparar 82 ul de solução de Nucleofector humano de células estaminais em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 18 ul de complemento 1. Misturar bem. Incubar solução a 37 ° C durante 5 mins. </li><li> Pré-aquecimento alimentador célula-condicionado meios de comunicação (CM) e 0,25% de tripsina / EDTA a 37 ° C. Sob o capô, prelabel um tubo estéril 15 ml. </li><li> Remova cuidadosamente a mídia da cultura iPSC humano a ser nucleofected. Lavar suavemente as células com 2 ml de solução de fosfato de 1X tampão (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 1 ml de tripsina a 0,25% por poço. Incube as células a 37 ° C durante 3 minutos. </li><li> Triturar suavemente as células com 1000 ml ponta da pipeta. Lava-se a parte inferior do poço, para garantir que todas iPSCs humanos são completamente separadas. Transferir a suspensão de células do tubo rotulado 15 ml cónico. </li></ol> Nota: tripsinização em c únicoells deve ser estritamente evitada. As células devem apenas ser desalojada em pequenos aglomerados de células consistiu em aproximadamente tripletos de células. Pequenos aglomerados de células (células triplos) será dissociado em células individuais durante o manuseamento subsequente das células. <ol start="7"><li> Adicionar 9 ml de mídia do MEF para inativar a tripsina. Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar o sedimento de células intactas. </li><li> Ressuspender as células em 100 uL de solução pré-aquecida de células estaminais humanas Nucleofector do Passo 3.3. </li><li> Transferir as células para uma cuvete de Nucleofector utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml. </li><li> Adicionar 4 ug de DNA do plasmídeo para a suspensão de células na cuvete. Misture células e de DNA por movimentos lentos. Toque a cuvete duas vezes sobre a superfície capuz. </li><li> Coloque a célula no suporte Nucleofector. Usar programas B-016. Células Nucleofect pressionando o botão X. </li></ol> &lt; <ok> &gt; Será exibida quando o processo nucleofection é completed (normalmente leva apenas 1-5 segundos). O uso de outros programas nucleofection (A-023, A-033 e U-023) produziram menos de 10% de células positivas para eGFP de iPSCs humanos. </ok><ol start="12"><li> Recuperar células da cuvete nucleofected usando a pipeta de Pasteur de plástico fornecido. Recuperar células por ressuspensão em CM pré-aquecido e inibidor de rocha em 1,5 ml estéril tubo eppendorf. Incube as células a 37 ° C durante 10 minutos para permitir que as células recuperam. </li><li> Células de transferência de gota a gota, em camadas de alimentação com 1 ml ponteira. Incubar as células a 37 ° C durante a noite. </li><li> Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte. Para obter clones estáveis ​​de transgênicos iPSCs humanos que expressam estavelmente transgene, mudar médio no dia seguinte com CM e inibidor ROCK. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Fotomicrografias de Riv1 iPSCs humanas transfectadas com pCAG-eGFP. (A) expressam eGFP Riv1 células transfectadas utilizando GeneJuice Geltrex em 12 horas pós-transf ecção. As colónias de Riv1 iPSCs humanos plaqueadas e formado em alimentadores seguintes nucleofection usando B-016 (B) e A-023 (C) do programa. (D) de forma estável que expressam eGFP-humanos colónias iPSC com expressão ubíqua eGFP derivado GeneJuice. (E) estavelmente transfectadas Riv1 iPSCs humanos retido expressão constitutiva eGFP durante a diferenciação do corpo embryoid.

<ol>
	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nosso resultado de protocolos de técnicas simples, robusto e altamente reprodutível para introduzir transgenes em iPSCs humanos sem efeitos tóxicos proeminente e morte celular. IPSCs humanos devem ser passadas em pedaços mais pequenos de células (células de 5-10) e plaqueadas em placas de Geltrex em alta densidade (1:2), para assegurar a eficiência de transfecção óptima em numerosas pequenas colónias. Para linhagens de iPSC que são mais propensos a diferenciação e morte celular, maior o número de iPSCs humanos (até 4 X 10 6 células) deve ser usada para uma experiência única nucleofection. Ensaio de transfecção transiente gera um grande número de transgenes que expressam iPSCs humanos dentro de 1 dia. Estavelmente transfectadas clones iPSC geralmente aparecem dentro de 7 dias, e essas colônias transgênicas deve estar pronto para ser escolhido dentro de três semanas. O uso de promotor CAG descrito aqui garante expressão ubíqua de repórter EGFP. Sob tais melhorias, nossos protocolos pode ser alimentado em outras aplicações, incluindo a superexpressão, cindução onditional, derivação de linhas de linhagem específica repórter, shRNA ou siRNA knockdown, a recombinação homóloga do gene alvo e.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina com EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3 milímetros pérolas de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-312A </td><td> Pérolas de vidro devem ser lavados com ácido clorídrico (HCl) durante a noite, lavada com hidróxido de sódio (NaOH) e água destilada, e esterilizadas por autoclavagem antes da utilização. </td></tr><tr><td> Célula Accutase reagente dissociação </td><td> Invitrogen </td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (glucose elevada) </td&gt; <td> Lonza </td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitela </td><td> Invitrogen </td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> Invitrogen </td><td> 12760013 </td><td> Fator de crescimento reduzido </td></tr><tr><td> GeneJuice reagente de transfecção </td><td> EMD Biosciences </td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td> L-glutamina (Invitrogen, 25030081) também podem ser usados ​​em seu lugar. </td></tr><tr><td> Humana iPSC KOSR mídia </td><td></td><td></td><td> 500 ml humano media ES consiste em 390 ml de DMEM KnockOut / F12, 100 ml de soro KnockOut Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), NEAA 5ml (100X), 500 ul de 2-mercaptoetanol (55 mm) e suplementado com 10 ng / ml bFGF . </td></tr><tr><td> KnockOut DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>Substituição KnockOut Soro (KOSR) </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Rato mídia fibroblastos embrionárias </td><td></td><td></td><td> MEF mídia consiste em 90% de FBS, NEAA 1X, 1X Glutamax-I e 1X piruvato de sódio, em meio DMEM (glucose elevada) </td></tr><tr><td> Aminoácido não essencial, NEAA? (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> Células estaminais humanas solução Nucleofector um com suplemento </td><td> Lonza </td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato sem Ca 2 + e Mg 2 + </td><td> Invitrogen </td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO meio kit </td><td> Invitrogen </td><td> A1000701 </td><td> 500 ml STEMPRO mídia consiste em 454 ml de KnockFora DMEM / F12, 10 ml STEMPRO suplemento de crescimento isento de soro (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml de BSA (albumina de soro bovino, 25%), 909 ul de 2-mercaptoetanol (55mm ) e suplementado com 10 ng / ml de bFGF. </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

A modificação genética continua a ser uma ferramenta essencial para o estudo da biologia de células-tronco e em estabelecer potenciais aplicações clínicas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) 1. Embora melhoramentos nos métodos de entrega de vários genes foram descritos 2-9, a transfecção continua a ser um processo caprichoso para hESCs, e ainda não foi relatado em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Neste vídeo, é mostrado como o nosso laboratório de rotina e transfects nucleofects iPSCs humanos utilizando plasmídeo com um verde fluorescente melhorada proteína repórter (eGFP). IPSCs humanos estão adaptados e mantidos como alimentador de culturas isentas de eliminar a possibilidade de a transfecção de células de alimentação e para permitir a selecção eficiente de clones estáveis ​​transgénicas iPSC após a transfecção. Para nucleofection, iPSCs humanos são pré-tratados com inibidor ROCHA 11, tripsinizadas em pequenos aglomerados de células, e novamente plaqueadas em nucleofected alimentadores de alimentador de células condicionadomeio para melhorar a recuperação de células. Transgene-expressam iPSCs humanos pode ser obtida depois de 6 horas. Selecção antibiótico é aplicado após 24 horas e estáveis ​​linhas transgénicas aparecer dentro de 1 semana. Nosso protocolo é robusto e reprodutível para linhagens iPSC sem alterar pluripotência destas células.

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Biologia

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

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In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

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A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

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