Name: selection of plasmodium falciparum parasites for cytoadhesion to human brain endothelial cells
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00
Duration: 10 min 9 s
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Agradecemos a Francisco Candal, CDC Oficina de Transferencia de Tecnología, Georgia Atlanta para HBEC-5i células. Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (4 años las becas para estudios de doctorado a la CA y la Beca Superior en Ciencias Biomédicas Básicas de JAR, número de concesión 084226).

Recomendaciones generales Microvascular cerebro humano las células endoteliales (HBEC-5i) la cultura se ha descrito anteriormente en 6, 8. P. los parásitos P. falciparum fueron cultivadas como en 9. Ambos HBEC-5i y P. falciparum parásito culturas deben mantenerse en condiciones estériles en todo momento. Todos los reactivos deben ser pre-calentado a 37 ° C. Se recomienda comprobar regularmente la contaminación por micoplasma 10 por PCR (Minevera Biolabs, las instrucciones del fabricante siguiente). El protocolo se resume en la figura 1. 1. De las células endoteliales cultivo de rutina <ol><li> Preparar los reactivos necesarios. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio para preparar </td><td> Reactivos </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> &quot;Incompleta DMEM&quot; </td><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Ynbsp; </td><td> L-glutamina 200 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicilina / estreptomicina 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (ajustar el pH a 7.4) </td></tr><tr><td> &quot;DMEM completo&quot; </td><td> &quot;Incompleta DMEM&quot; </td><td> 450 ml </td></tr><tr><td></td><td> Suero bovino fetal inactivado por calor </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> De las células endoteliales suplemento de crecimiento </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura HBEC-5i en un respiradero de 25cm 2 frasco con 10 ml de medio DMEM completo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Las células de paso cuando se hacen confluentes. Eliminar el medio de edad por succión y lavar dos veces con medio DMEM incompleto o cultivo de tejidos de grado PBS (Ca 2 + y Mg 2 + libre) pre-calentado a 37 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de pre-calentado TratePSIN-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA) en forma de remolino para cubrir la totalidad del frasco y se incuba durante ~ 2 min a 37 ° C. </li><li> Revisar bajo microscopio invertido al menos el 90% de las células se han separado. Si es necesario, suavemente golpee el fondo del frasco para desprender las células adherentes. Añadir 10 ml de medio DMEM completo para bloquear las células tripsina y la transferencia en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar durante 4 min a 300 g, a temperatura ambiente (TA). </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 10 ml de medio DMEM completo. Pipeta la solución de arriba y abajo para volver a suspender completamente las células. </li><li> Agregar 1 o 2 ml de la suspensión de células en un frasco de cultivo nuevo y añadir 8 ml de medio fresco para mantener la cultura. Evaluar el crecimiento de la cultura todos los días bajo un microscopio invertido y el cambio medio de cada 2 o 3 días antes de que se vuelve amarillo. </li></ol> 2. Preparación de las células endoteliales para una selección <ol><li> Dos días antes del día de la selectio<html> n, añade fibronectina diluido en PBS estéril (2 mg / cm 2) en una (o más) 60 mm placa de Petri. Incubar la placa durante 5 a 20 min a 37 ° C, extraer la solución de fibronectina, que pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un mes y volver a utilizarse una vez. </li><li> Las células de paso como se describe en las secciones 1.3. a 1,5. Asumiendo el 100% de células confluentes se separaron y se resuspendieron en 10 ml de medio DMEM completo (sección 1.6., Volver a suspender con un volumen equivalente de medio si la confluencia es menor, por ejemplo, volver a suspender con 8 ml si la confluencia fue del 80%), añadir 1,5 ml de la suspensión las células a la placa recubierta de fibronectina Petri y otro 1,5 ml de medio DMEM completo. </li><li> Coloque el plato de Petri sembradas en la incubadora. Nota: Lo ideal sería que la confluencia será de alrededor de 90% en el momento de la selección de dos días más tarde. </li><li> Opcional. Para activar HBEC-5i, agregue el TNF (Factor de Necrosis Tumoral) de citoquinas a una concentración final de 50μg/ml 24 horas antes de la selección. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Plasmodium falciparum cultivo de rutina <ol><li> Preparar los reactivos necesarios (ver tabla aquí debajo). Prepare los glóbulos rojos (GR) por la separación de sangre total (grupo O +) por el paso a través de un filtro de los leucocitos (véase &quot;Métodos de Investigación de Paludismo&quot;, la publicación 11 de la malaria en general el cultivo de parásitos). Lavar dos veces al RBC por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y resuspender con 10 ml de RPMI incompleto. Mantenga lava RBC a 4 ° C en medio incompleto el 50% de hematocrito. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio para preparar </td><td> Reactivos </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> &quot;Incompleta RPMI&quot; </td><td> RPMI 1640 (con bicarbonato) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucosa al 20% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td&gt; <td> L-glutamina 200 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (ajustar el pH a 7.2) </td></tr><tr><td> &quot;RPMI completo&quot; </td><td> &quot;Incompleta RPMI&quot; </td><td> 450 ml </td></tr><tr><td></td><td> Humano agrupado (no inmunes) de suero </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultivo de P. falciparum infectados RBC con medio RPMI completo en el 2% de hematocrito y se incuba a 37 ° C con el 3% de CO 2, 1% O 2, y 96% N 2. Realizar frotis de Giemsa 11 todos los días para evaluar el grado de desarrollo de los parásitos (Figura 2). </li><li> Regularmente (aproximadamente una vez por semana) sincronizar la cultura por el tratamiento de sorbitol 12. El día antes de la selección del ensayo, el objetivo de una cultura de anillo etapa en 5% de parasitemia o más (lo ideal es por lo menos 10%). </li></ol> 4. Selección de P. falciparum de cytoadhesion a las células endoteliales <ol><li> En el día de la prueba, el cultivo de parásitos deben estar en fase de trofozoito pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), mientras que HBEC-5i la cultura debe ser de 50 a 100% de confluencia (idealmente 90%). 30μl volumen celular de cultivo de parásitos que se necesita por HBEC-5i placa de Petri. </li><li> Lavar dos veces los parásitos por centrifugación (500 g por 5 min) 1,5 ml de cultivo de parásitos. Desechar el sobrenadante y resuspender con 10 ml de recién hecho, caliente, medio DMEM incompleto. Repetir el lavado por segunda vez. Resuspender el 30μl volumen celular con 1,5 ml de incompleta con BSA al 1% DMEM. </li><li> Lavar el plato recubierto HBEC-5i Petri doble aspiración de mediano y agregar 3 ml de DMEM incompleto. </li><li> Añadir la solución de los parásitos al plato HBEC-5i y se incuba a 37 ° C durante 75 min. Resuspender los parásitos en dos ocasiones (después de 30 y 60 minutos) durante la incubaciónmoviendo suavemente el plato en las cuatro direcciones, así como las agujas del reloj y en sentido contrario. </li><li> Después de la incubación, lavar el plato cinco veces por medio de aspiración, utilizando una pipeta de plástico Pasteur para añadir 3 ml de medio DMEM incompleto cálido y suave balanceo. Si los platos se están usando, guárdelas en una superficie caliente, como un frasco lleno de agua a 37 ° C. </li><li> Revise el plato bajo un microscopio invertido. Si muchos no infectada RBC son todavía visibles, hacer más lavados como se describió anteriormente. Manejar la placa de Petri con mucho cuidado para evitar cualquier riesgo de contaminación. </li><li> Quitar medio del plato y añadir 3 ml de agua tibia medio RPMI completo con un volumen de 40μl hematocrito de uRBC fresco. </li><li> Coloque el plato en una cámara hermética de incubación, gas, durante 3 minutos y colocar la cámara en una incubadora a 37 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, la cosecha de los parásitos mediante el lavado con medio RPMI incompleto, de un modo similar al descrito en la sección 4.4. pero con más fuerza. Keep todos los medio de comunicación utilizado (que contiene resuspendido RBC) en un tubo cónico de 15 ml. Revisar bajo microscopio invertido que todos los glóbulos rojos se han eliminado de la antena. </li><li> Se precipitan los parásitos, descartar el sobrenadante, resuspender en 5 ml de medio RPMI completo y colocar la mezcla en un frasco de cultivo normal. </li></ol> 5. Resultados representante Parásitos no seleccionados muestran un bajo nivel de la unión a HBEC-5i (Figura 3). Así, después de la primera ronda de selección, muy pocos parásitos serán cosechados y puede tomar hasta un mes de cultivo para llegar a una parasitemia suficiente para la segunda ronda de selección. Después de cada ronda de selección, los parásitos más y más se unen a las células endoteliales y las selecciones se pueden repetir a intervalos de tiempo más corto. Después de 4-5 rondas de selección, de alta vinculante poblaciones de parásitos se obtienen (Figura 3). En nuestras manos, la unión de HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF activa HBEC-5i fue de simnivel de ILAR (datos no mostrados). El protocolo descrito aquí se ha probado con 4 P. falciparum cepas: HB3, IT/FCR3, 3D7 y Dd2 (Tabla 1). Sólo este último no se ha demostrado capaz de unirse a HBEC-5i, incluso después de 5 rondas de selección. HB3 parásitos también fueron seleccionados para cytoadherence a dérmicos humanos y pulmonar células endoteliales microvasculares (HDMEC y HPMEC). Después de cuatro rondas de selección, utilizando el método descrito aquí, una población de alto vinculante se obtuvo en ambos HDMEC y HPMEC (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general del proceso de selección. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" /> Figura 2. Etapas de desarrollo de P. falciparum infectados glóbulos rojos. Frotis de Giemsa visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" /> Figura 3. Un ejemplo típico de los parásitos unión a HBEC-5i. (A) La capa azul es HBEC-5i fija con glutaraldehído y se tiñeron con Giemsa, visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X. Fotografías fueron tomadas después de uRBC y iRBC consolidados fueron arrasadas. El panel izquierdo muestra una sola P. falciparum HB3 (no seleccionado) parásito obligado a HBEC-5i. En el panel derecho de los parásitos HB3-HBEC había sido seleccionado por 5 rondas. (B) Los datos representan el promedio de dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El número de parásitos obligados por las células endoteliales se había contado. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" /> Tabla 1. Resumen de Plasmodium falciparum cepas que se han seleccionado con éxito por la unión a HBEC-5i. Tenga en cuenta que HB3 también fue seleccionado en el TNF-activa HBCE-5i. Después de 5 rondas de selección, la cepa Dd2 no mostró ningún aumento en la unión a HBEC-5i en comparación con el no seleccionado-Dd2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" /> Figura 4. La unión de P. falciparum HB3 parásitos dérmicos (HDMEC) y pulmonar (HPMEC) las células endoteliales, antes y después de cuatro rondas de selección. pesar de que el medio de cultivo para HDMEC y HPMEC difiere ligeramente (ver instrucciones del proveedor), el protocolo utilizado para la selección es idéntico al igual que con HBEC-5i. Las imágenes tomadas con una ampliación de 400X. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Por medio DMEM y RPMI completo </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 100X (10.000 unidades / ml y 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal inactivado por calor </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> De las células endoteliales suplemento de crecimiento </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> El cultivo de tejidos tratados 60 mm X 15 mm cajas de Petri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectina humana </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> El uso de 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> I +D Systems </td><td> 210-TA </td><td> opcional, el uso de 50 mg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167F </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> Be17-737E </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> La línea celular primaria </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> La línea celular primaria </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Se obtiene de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Materiales

<ol>
	<li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+malaria:+in+situ+switching,+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum.">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li><li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration.">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li><li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children.">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li><li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts.">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li><li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria:+sequestration,+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction.">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li><li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain.">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li><li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications.">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li><li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells.">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li><li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum.">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li><li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication.">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li><li>Moll, K., Ljungstr&#246;m, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2009).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li><li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor(s)+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface.">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li><li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMP-420,+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria.">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li><li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum.">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El sello distintivo de la malaria cerebral es la retención de P. falciparum iRBC dentro del cerebro microvasculatura 2, 3. Sin embargo, en cultivos in vitro de P. falciparum sólo poco a cytoadhere HBEC-5i, un modelo para el endotelio microvascular cerebro humano. Aquí hemos desarrollado un ensayo sencillo para enriquecer a una población de la unión a HBEC-5i, uno más &quot;in-vivo como&quot; fenotipo. Tres de cada 4 P. cepas de P. falciparum se han seleccionado con éxito utilizando este método. Además, HB3 también fue seleccionado en HDMEC y HPMEC, lo que indica que este protocolo se puede utilizar para los parásitos y diversos tipos de células endoteliales. Diferentes hipótesis pueden explicar la falta de unión con la cepa Dd2. La más probable es que el hecho de que esta línea parásito sin botón, lo que impide la profunda cytoadherence 13, 14. Se recomienda el cultivo de parásitos seleccionados junto a la selección de proproceso para proporcionar un control de comparación. Esto permitirá, por ejemplo, comparar el transcriptoma de los parásitos vinculantes y no vinculantes, con la esperanza de descubrir los candidatos parásito ligando. TNF es una citocina encontrado a un alto nivel en los pacientes con paludismo cerebral y ha sido mostrar a inducir la expresión de proteínas de la superficie muchos de HBEC-5i (Claessens et al, en preparación y 8, 15, 16). En este caso, la cantidad de iRBC obligado fue similar en condiciones normales HBEC-5i en comparación con el activo HBEC-5i. Este &quot;modelo de secuestro&quot;, también se puede utilizar para estudiar la interacción molecular entre el iRBC y las células endoteliales, así como el efecto de la supuesta cytoadherence anti-drogas. En este caso, se recomienda placas HBEC-5i en pequeños pozos, tales como la &quot;cámara de diapositivas de 8 pocillos&quot; (BD 354 628) o &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selection of plasmodium falciparum parasites for cytoadhesion to human brain endothelial cells

La mayoría de las muertes por malaria humana es causada por el Plasmodium estadio en sangre los parásitos P. falciparum. La malaria cerebral, la complicación más mortal de la enfermedad, se caracteriza por una acumulación de Plasmodium falciparum los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la etapa de trofozoíto pigmentadas en la microvasculatura del cerebro 2-4. Esta obstrucción microvascular (secuestro) conduce a la acidosis, la hipoxia y perjudiciales citoquinas inflamatorias (revisado en 5). El secuestro también se encuentra en la mayoría de los tejidos microvascular del cuerpo humano 2, 3. El mecanismo por el cual iRBC adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos aún es poco conocido. La línea inmortalizada Humanos microvascular cerebral de células endoteliales (HBEC-5i) ha sido utilizado como un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro 6. Sin embargo, el Plasmodium falciparum iRBC adjuntar sólo poco a HBEC-5i in vitro, a diferencia de la densa sequestrationes que se produce en los casos de malaria cerebral. Por lo tanto, desarrolló un ensayo panorámico para seleccionar (enriquecer) varias P. falciparum cepas para la adhesión a HBEC-5i para obtener poblaciones de alto vinculante parásitos, más representativo de lo que ocurre in vivo. Una muestra de un cultivo de parásitos (mezcla de iRBC y no infectados RBC) en la fase de trofozoito pigmentadas se lava y se incubaron en una capa de HBEC-5i cultivadas en una placa de Petri. Después de la incubación, el plato está cuidadosamente lavados de uRBC iRBC y no consolidados. Fresco uRBC se añaden a la iRBC pocas condiciones para HBEC-5i y se incubaron durante la noche. Como los parásitos esquizonte etapa explosión, merozoitos reinvade RBC y los parásitos en el estadio de anillo se cosechan al día siguiente. Los parásitos se cultivan hasta que se obtiene material suficiente (generalmente de 2 a 4 semanas) y una nueva ronda de selección se puede realizar. Dependiendo de la P. falciparum cepa, de 4 a 7 rondas de selección son necesarios para obtener una poblacióndonde la mayoría de los parásitos se unen a HBEC-5i. El fenotipo de la unión se pierde progresivamente a las pocas semanas, lo que indica un cambio en la expresión del gen del antígeno de superficie variante, por lo tanto la selección regular de HBEC-5i es necesaria para mantener el fenotipo. En resumen, hemos desarrollado un ensayo de selección de la representación P. falciparum parásitos más &quot;adhesivo malaria cerebral&quot; fenotipo. Hemos sido capaces de seleccionar 3 de cada 4 P. falciparum cepas de HBEC-5i. Este ensayo también ha sido utilizado con éxito para seleccionar los parásitos de la unión a las células endoteliales humanas dérmicas y pulmonares. Es importante destacar que este método puede ser usado para seleccionar tejidos específicos poblaciones de parásitos a fin de identificar ligandos candidato parásito para la unión al endotelio cerebral. Por otra parte, este ensayo puede ser utilizado para detectar el supuesto secuestro de medicamentos anti-7.

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el secuestro de la malaria cerebral se describe<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los glóbulos rojos infectados son seleccionados para unirse al inmortalizado células del cerebro humano endoteliales microvasculares. Los parásitos seleccionados muestran un fenotipo distinto. El proceso de selección pueden ser aplicados utilizando diversos<em&gt; P. falciparum</em&gt; Cepas y líneas de células endoteliales.

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Research

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An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrocitos&gt; por el VIH en un recurso pobre ajuste

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...