Name: live imaging of dorsal root axons after rhizotomy
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00
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Nous remercions le Dr Alan Tessler pour les commentaires et l&#39;aide éditoriale. Ce travail a été soutenu par le NIH NS062320.

1. Microscope mis en place et la préparation d&#39;imagerie <ol><li> Notre kit se compose d&#39;imagerie d&#39;un stéréomicroscope Leica MZ16 fluorescent avec une vitesse d&#39;obturation rapide et une caméra CCD refroidie contrôlé par un logiciel Metamorph. </li><li> Préparer un coussin chauffant thermostaté et d&#39;ajuster la sortie à 32,5 ° C pour maintenir la température du corps de l&#39;animal pendant et après la chirurgie. </li><li> Chaud solution de Ringer stérile ou artificielle liquide céphalo...

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

Imagerie DR directement dans la régénération de vie des souris est particulièrement difficile car il nécessite une laminectomie dorsale substantielle pour surveiller la croissance des axones sur une large zone suivie par plusieurs interventions chirurgicales effractives et anesthésiques à des séances d&#39;imagerie ultérieurs. Plusieurs stratégies ont aidé à surmonter ces défis. Premièrement, l&#39;imagerie réussie nécessaire de réduire la mortalité de la souris (environ 25%) en minimisant la durée de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Ligne H Thy1-YFP (2-4 mois, soit le sexe) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (injection AnaSed, solution stérile) </td><td> Laboratoires Lloyd, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> La kétamine (chlorhydrate de kétamine par injection, USP) </td><td> Hospira, Inc (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> La buprénorphine (injectable Buprenex) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Petite tondeuse poils </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Lotion Épilation </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR avec Baby Oil </td><td></td></tr><tr><td> Compresses de gaze </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Coton-tige tampons </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 à 960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> Seringues de 1 ml </td><td> Becton, Dickson et Société Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Sous-cutanée (sous-Q) aiguilles, Calibre 26. </td><td> Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Des ciseaux et des pinces à ressort </td><td> Outils Fine Science, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm Rongeurs courbes </td><td> Outils Fine Science, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Injection de Ringer lactate USP </td><td> B. Braun Medical Inc (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Une solution saline stérile </td><td> APP Pharmaceuticals (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Mince membrane matrice synthétique (Biobrane) </td><td> Pharmaceuticals Bertek, (Morgantown) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial durée </td><td> Gore Empêcher MVP Dura substitution, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 sutures de soie </td><td> Ethicon, Inc (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Clips des plaies </td><td> Parfait - Ets Bruneau, (Burnea, France) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Stéréomicroscope fluorescent </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Allemagne) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu, de Bridgewater (NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Régulateur de température </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, Floride) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph logiciels </td><td> Molecular Devices (Sunnyvale, Californie) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Les axones sensoriels primaires blessés par des blessures profondes épinière ne parviennent pas à régénérer dans la moelle épinière, entraînant des douleurs chroniques et permanents perte sensorielle. Régénération de la racine dorsale (DR) axones dans la moelle épinière est empêché à la dorsale d&#39;entrée de zone racine (DREZ), l&#39;interface entre le SNC et du SNP. Notre compréhension des événements moléculaires et cellulaires qui empêchent la régénération au DREZ est incomplète, en partie parce que les changements complexes associées à des lésions nerveuses ont été déduites à partir d&#39;analyses post-mortem. Dynamique des processus cellulaires, telles que la régénération des axones, sont les mieux étudiés avec les techniques que la capture en temps réel des événements avec de multiples observations de chaque animal vivant. Notre capacité à surveiller les neurones en série in vivo a augmenté de façon spectaculaire grâce à des innovations révolutionnaires en matière d&#39;optique et de la souris transgénique. Plusieurs lignes de souris transgéniques Thy1-GFP, dans les sous-ensembles de neurones sont génétiquement distincts étiquetés dans des couleurs fluorescentes, permis de neurones individuels à imager in vivo 1. Ces souris ont été largement utilisés pour l&#39;imagerie in vivo de muscle 2-4 et le cerveau 5-7, et ont fourni de nouvelles connaissances sur les mécanismes physiologiques qui analyse statique ne pouvait pas résolu. Les études d&#39;imagerie des neurones dans la moelle épinière de vie n&#39;ont commencé que récemment. Lichtman et ses collègues ont d&#39;abord démontré leur faisabilité par le suivi des blessés dorsale colonne (CC) avec de larges axones microscopie à champ 8,9. Multi-photon dans l&#39;imagerie in vivo des axones CC profondément positionnée, la microglie et les vaisseaux sanguins ont également été accomplis 10. Au cours des dernières années, nous avons été les premiers à appliquer l&#39;imagerie in vivo pour contrôler la régénération des axones DR utilisant la microscopie à champ large et la ligne H du Thy1-YFP souris. Ces études nous ont conduit à une nouvelle hypothèse sur les raisons axones DR sont empêchés de régénération dans la moelle épinière 11. Dans la ligne H du Thy1-YFP souris, distincte YFP axones + sont superficiellement placés, ce qui permet plusieurs axones être surveillés simultanément. Nous avons appris que les axones DR arrivant à DREZ sont mieux imager dans lombaire que dans la moelle épinière cervicale. Dans le présent rapport, nous décrivons plusieurs stratégies que nous avons trouvé utile d&#39;assurer avec succès l&#39;imagerie à long terme et répétées des axones régénérant DR. Il s&#39;agit notamment de méthodes qui éliminent l&#39;intubation et l&#39;interruption répétée des voies respiratoires, de minimiser la chirurgie associée stress et la formation de cicatrices, et acquérir des images stables à haute résolution sans phototoxicité.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Une<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie protocole à suivre axones sensoriels primaires suivantes écraser la racine dorsale est décrite. Les procédures utilisent à grand champ microscopie par fluorescence et Thy1-YFP souris transgéniques, et permettent une imagerie répétée de la régénération des axones plus de 4 cm dans le SNP et les interactions avec l&#39;interface axone du SNC.

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enrichissement de cultures de neurones ganglionnaires de la racine dorsale de souris adultes par immunopanoramique

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...