Name: live imaging of dorsal root axons after rhizotomy
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00
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Ringraziamo il Dott. Alan Tessler per i commenti e aiuto editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NS062320.

1. Microscopio impostare e preparazione di imaging <ol><li> Il nostro set è composto da immagini di uno stereomicroscopio Leica MZ16 fluorescente con un otturatore veloce e una camera CCD raffreddata controllato dal software Metamorph. </li><li> Preparare una piastra elettrica termostato e regolare uscita a 32,5 ° C per mantenere la temperatura del corpo dell&#39;animale durante e dopo l&#39;intervento. </li><li> Caldo Ringer sterile la soluzione o artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) a 32,5 ° C in anticipo pe...

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

Imaging DR rigenerazione direttamente in topi vivi è particolarmente impegnativa perché richiede una notevole laminectomia dorsale di monitorare la crescita degli assoni su una vasta area seguito da più interventi chirurgici invasivi e anestesia nelle sessioni successive di imaging. Diverse strategie aiutato a superare queste sfide. In primo luogo, l&#39;imaging di successo richiede la riduzione della mortalità del mouse (circa il 25%), riducendo al minimo la durata dell&#39;anestesia e sanguinamento, e da una metic...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Linea H Thy1-YFP (2-4 mesi di età, entrambi i sessi) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina (iniezione AnaSed, soluzione sterile) </td><td> Laboratori Lloyd, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> La ketamina (iniezione ketamina cloridrato, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, Illinois) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorfina (iniettabile Buprenex) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Piccoli animali Tagliacapelli </td><td> Oster Professionale, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Depilazione lozione </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR con Baby Olio </td><td></td></tr><tr><td> Garza spugne </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi di cotone con punta </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14-960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> Siringhe da 1 ml </td><td> Becton, Dickson e Company Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Sottocutanea (Sub-Q) aghi, 26ga. </td><td> Becton, Dickson e Società (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici e pinze a molla </td><td> Strumenti Scienza fine, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeurs curve da 2,5 mm </td><td> Strumenti Scienza fine, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Iniezione Ringer lattato USP </td><td> B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina sterile </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Sottile membrana matrice sintetica (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Dura artificiale </td><td> Gore Impedire MVP Sostituto Dura, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 punti di sutura di seta </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Ferita clip </td><td> Perfetto - Ets Bruneau, (Burnea, Francia) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscopio a fluorescenza </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Germania) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Controllore di temperatura </td><td> Mondo Strumenti di precisione (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> I dispositivi molecolari, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Gli assoni sensoriali primarie ferito da lesioni radice spinale non riescono a rigenerarsi nel midollo spinale, con conseguente dolore cronico e permanente perdita di sensibilità. Rigenerazione della radice dorsale (DR) assoni nel midollo spinale è impedito l&#39;ingresso in zona dorsale principale (DREZ), l&#39;interfaccia tra il SNC e SNP. La nostra comprensione degli eventi molecolari e cellulari che impediscono la rigenerazione a DREZ è incompleta, in parte perché i cambiamenti complessi associati a danno del nervo sono stati dedotti dalle analisi post-mortem. Dinamica dei processi cellulari, come la rigenerazione degli assoni, sono i migliori studiati con tecniche che catturano eventi in tempo reale con le osservazioni più di ogni animale vivente. La nostra capacità di monitorare i neuroni in serie in vivo, è aumentato drammaticamente a causa di innovazioni rivoluzionarie nel campo dell&#39;ottica e mouse transgenici. Diverse linee di Thy1-GFP topi transgenici, nei quali sottopopolazioni di neuroni sono geneticamente etichettati in distinti colori fluorescenti, consentono singoli neuroni di essere ripreso in vivo 1. Questi topi sono stati ampiamente utilizzati per imaging in vivo dei muscoli e del cervello 2-4 5-7, e hanno fornito indicazioni romanzo in meccanismi fisiologici che le analisi statiche non poteva essere risolto. Studi di imaging di neuroni nel midollo spinale di vita hanno cominciato solo di recente. Lichtman ei suoi colleghi hanno dimostrato la loro fattibilità per il monitoraggio feriti colonna dorsale (DC) assoni con grande campo microscopia 8,9. Multi-fotone in imaging in vivo di profondamente posizionati assoni DC, microglia e dei vasi sanguigni è stato anche compiuto 10. Nel corso degli ultimi anni, siamo stati i primi ad applicare imaging in vivo di monitorare la rigenerazione degli assoni DR utilizzando la microscopia a largo campo e la linea H del Thy1-YFP topi. Questi studi ci hanno portato ad una nuova ipotesi sul perché gli assoni DR viene impedito di rigenerazione nel midollo spinale 11. In linea H del Thy1-YFP topi, distinto YFP assoni + sono posizionati superficialmente, che consente assoni diversi da monitorare contemporaneamente. Abbiamo imparato che gli assoni DR arrivare a DREZ sono meglio ripreso in lombare che nel midollo spinale cervicale. Nella presente relazione si descrivono diverse strategie che abbiamo trovato utile per assicurare il successo di imaging a lungo termine e ripetuti di rigenerare gli assoni DR. Tra questi metodi che eliminano l&#39;intubazione ripetute e interruzione delle vie respiratorie, ridurre al minimo la chirurgia associata a stress e la formazione di cicatrici, e di acquisire immagini stabili ad alta risoluzione senza fototossicità.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Immagini di protocollo per monitor principale assoni sensoriali seguenti schiacciare spinali è descritto. Le procedure di utilizzo ad ampio campo di microscopia a fluorescenza e topi transgenici Thy1-YFP, e permettere l&#39;imaging ripetuta di rigenerazione degli assoni più di 4 cm nel SNP e le interazioni degli assoni con l&#39;interfaccia del sistema nervoso centrale.

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Ricerca

Neuroscienze

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...