Name: live imaging of dorsal root axons after rhizotomy
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00
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Agradecemos ao Dr. Alan Tessler para comentários e ajudar a editorial. Este trabalho foi financiado pelo NIH NS062320.

1. Microscópio de configurar e preparação de imagens <ol><li> Nossa imagem criada é constituída de um estereomicroscópio Leica MZ16 fluorescente com um disparo mais rápida e uma câmera CCD refrigerado controlado por software Metamorph. </li><li> Prepare uma almofada de aquecimento controlada por termostato e ajustar a saída de 32,5 ° C para manter a temperatura corporal do animal durante e após a cirurgia. </li><li> Solução de Ringer estéril morna ou líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) a 32,5 °...

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

DR regeneração imagem diretamente em ratos vivos é particularmente desafiador, porque exige uma laminectomia dorsal substancial para monitorar o crescimento do axônio em uma ampla área seguido por vários procedimentos cirúrgicos invasivos e anestésico em sessões de imagem subseqüentes. Várias estratégias ajudaram a superar esses desafios. De imagem, primeiro sucesso requerida a redução da mortalidade mouse (aproximadamente 25%), minimizando a duração da anestesia e sangramento, e pelo cuidado pós-operat...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> H linha thy1-YFP (2-4 meses de idade, ambos os sexos) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (injeção AnaSed, solução estéril) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> Ketamina (injeção de cloridrato de ketamina, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Buprenex injetável) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Cortar cabelo de pequenos animais </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Loção depilação </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR com Baby Oil </td><td></td></tr><tr><td> Esponjas de gaze </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Cotonetes </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14-960-3T </td><td></td></tr><tr><td> Seringas de 1 mL </td><td> Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subcutânea (Sub-Q) agulhas, 26ga. </td><td> Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras e pinças de primavera </td><td> Multa Ferramentas Science, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De 2,5 mm fórceps curvos </td><td> Multa Ferramentas Science, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Injeção de Ringer com lactato USP </td><td> B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina estéril </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana fina matriz sintética (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial dura </td><td> Gore Impedir MVP Substituto Dura, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 de seda </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Grampos de sutura </td><td> Perfeito - Ets Bruneau, (Burnea, França) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscópio fluorescentes </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Alemanha) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Mundial Precision Instruments (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Os dispositivos moleculares, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Os axônios sensoriais primárias feridos por lesões de raízes nervosas não conseguem regenerar na medula espinhal, levando à dor crônica e perda sensorial permanente. Regeneração da raiz dorsal (DR) em axônios da medula espinhal é impedido na raiz dorsal entrada de zona (DREZ), a interface entre o CNS e PNS. Nossa compreensão dos eventos moleculares e celulares que impedem a regeneração em DREZ está incompleto, em parte porque as mudanças complexas associadas a lesão do nervo ter sido deduzida a partir de análises pós-morte. Dinâmicos processos celulares, tais como a regeneração de axônios, são melhor estudadas com técnicas que capturam eventos em tempo real com múltiplas observações de cada animal vivo. Nossa capacidade de acompanhar os neurônios em série in vivo aumentou dramaticamente devido a inovações revolucionárias em óptica e transgênicos mouse. Várias linhas de camundongos transgênicos thy1-GFP, na qual subconjuntos de neurônios são geneticamente distintos rotulados em cores fluorescentes, permitem que os neurônios individuais a ser trabalhada in vivo 1. Esses camundongos têm sido amplamente utilizadas para in vivo de imagens de músculo 2-4 e 5-7 cérebro, e forneceram introspecções novas nos mecanismos fisiológicos que análises estáticas não poderia ter resolvido. Estudos de imagem de neurônios da medula espinhal em viver só recentemente começaram. Lichtman e seus colegas demonstraram a sua viabilidade através do rastreamento feridos coluna dorsal (DC) com axônios de grande campo de microscopia de 8,9. Multi-fotão in vivo de imagens de axônios profundamente posicionado DC, microglia e os vasos sanguíneos também tem sido realizados 10. Ao longo dos últimos anos, somos pioneiros na aplicação de imagem in vivo para monitorar a regeneração de axônios DR usando gama microscopia de campo e linha de H thy1-YFP camundongos. Esses estudos nos levaram a uma nova hipótese sobre por que os axônios DR são impedidos de regeneração dentro da medula espinhal 11. H em linha de thy1-YFP ratos, distinto axônios YFP + são superficialmente posicionado, o que permite que vários axônios ser monitorados simultaneamente. Aprendemos que os axônios DR chegar a DREZ são melhores visualizados na lombar do que na medula espinhal cervical. No presente relatório, nós descrevemos várias estratégias que temos encontrado útil para garantir a imagem de longo prazo e repetiu sucesso dos axônios em regeneração DR. Estes incluem métodos que eliminam intubação repetidas e interrupção respiratória, minimizar a cirurgia associada à tensão e formação de cicatrizes, e adquirir imagens estáveis ​​em alta resolução sem fototoxicidade.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de protocolo para monitor principal axônios sensitivos seguintes esmagar raiz dorsal é descrito. Utilizar os procedimentos de campo amplo de microscopia de fluorescência e thy1-YFP camundongos transgênicos, e permitir que imagens repetidas de regeneração de axônios mais de 4 cm no PNS e interações com a interface do axônio do SNC.

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Neurociência

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...