Name: live imaging of dorsal root axons after rhizotomy
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00
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Agradecemos al Dr. Alan Tessler por sus comentarios y ayuda editorial. Este trabajo fue apoyado por el NIH NS062320.

1. Microscopio de configurar y preparación de imágenes <ol><li> Nuestra imagen creada se compone de un microscopio estereoscópico Leica MZ16 fluorescentes con una velocidad de obturación rápida y una cámara CCD enfriado controlado por el software Metamorph. </li><li> Prepare una almohadilla térmica de temperatura controlada y ajustar la producción a 32,5 ° C para mantener la temperatura corporal del animal durante y después de la cirugía. </li><li> Ringer tibia estéril la solución o líquido cefalorraquí...

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

DR regeneración de imagen directamente en ratones vivos es particularmente difícil porque requiere una laminectomía dorsal sustancial para controlar el crecimiento del axón en una amplia zona seguido por múltiples procedimientos invasivos quirúrgicos y anestésicos en las sesiones de formación de imágenes posteriores. Las estrategias que han contribuido a superar estos retos. Imágenes en primer lugar, el éxito requiere la reducción de la mortalidad del ratón (aproximadamente el 25%), reduciendo al mínimo la...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> H línea thy1-YFP (2-4 meses de edad, ambos sexos) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (inyección AnaSed, solución estéril) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> La ketamina (inyección de clorhidrato de ketamina, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> La buprenorfina (inyectable Buprenex) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeñas máquinas de cortar el pelo de animales </td><td> Oster Profesional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Loción capilar eliminación </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR con aceite para bebé </td><td></td></tr><tr><td> Gasas </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Con puntas de algodón </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 a 960-3T </td><td></td></tr><tr><td> Jeringas de 1 ml </td><td> Becton, Dickinson y Compañía Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subcutánea (Sub-Q) agujas, 26ga. </td><td> Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras y pinzas de primavera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm gubia curva </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer USP Inyección </td><td> B. Braun Medical Inc. (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina estéril </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana delgada matriz sintética (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, Virginia Occidental) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial dura </td><td> Gore Impedir MVP sustituto Dura, WL Gore &amp; Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 suturas de seda </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Clips de la herida </td><td> Perfecto - Ets Bruneau, (Burnea, Francia) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Estereoscópico fluorescente </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Alemania) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Los axones sensoriales primarias heridos por lesiones raíz espinal no se regeneran en la médula espinal, causando dolor crónico y pérdida sensorial permanente. La regeneración de la raíz dorsal (DR) los axones en la médula espinal se previene en la zona de la raíz dorsal de entrada (DREZ), la interfaz entre el SNC y SNP. Nuestra comprensión de los eventos moleculares y celulares que impiden la regeneración en DREZ es incompleta, en parte debido a los cambios complejos asociados con la lesión del nervio se han deducido del análisis post-mortem. Dinámica de procesos celulares, tales como la regeneración axonal, se estudia mejor con las técnicas que la captura de eventos en tiempo real con múltiples observaciones de cada animal vivo. Nuestra capacidad para controlar las neuronas en serie en vivo ha aumentado dramáticamente debido a las innovaciones revolucionarias en la óptica y los transgénicos de ratón. Varias líneas de thy1-GFP ratones transgénicos, en el que los subgrupos de neuronas son genéticamente etiquetados en distintos colores fluorescentes, permiten las neuronas individuales para ser captado en vivo 1. Estos ratones se han utilizado ampliamente para imágenes in vivo de los músculos y el cerebro 2-4 5-7, y han proporcionado nuevos conocimientos sobre los mecanismos fisiológicos que los análisis estáticos no se podría haber resuelto. Los estudios de imágenes de las neuronas en la médula espinal que viven sólo recientemente han comenzado. Lichtman y sus colegas han demostrado su viabilidad mediante el seguimiento de heridos columna dorsal (DC), los axones con un amplio campo de la microscopía 8,9. Multi-fotón de imágenes in vivo de la profunda posición axones DC, microglia y los vasos sanguíneos también se ha logrado 10. En los últimos años, hemos sido pioneros en la aplicación de imágenes in vivo para controlar la regeneración de los axones DR con amplio campo de la microscopía y la línea H de thy1-YFP ratones. Estos estudios nos han llevado a una nueva hipótesis acerca de por qué los axones DR se les impide la regeneración de la médula espinal 11. En la línea H de thy1-YFP ratones, distintas YFP + axones son superficialmente posición, que permite a varios axones a ser monitoreados simultáneamente. Hemos aprendido que los axones DR llegar a DREZ son mejores imágenes en el lumbar que en la médula espinal cervical. En el presente informe se describen varias estrategias que nos han sido útiles para asegurar imágenes de éxito a largo plazo y de la regeneración de los axones repetidas DR. Estos incluyen métodos que eliminan la intubación y la interrupción de las vías respiratorias repetidas, minimizar la cirugía asociada con el estrés y la formación de cicatrices, y obtener imágenes estables en alta resolución sin fototoxicidad.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de protocolo para monitor principal axones sensoriales después de aplastar a la raíz dorsal se describe. Utilizar los procedimientos de campo amplio microscopía de fluorescencia y thy1-YFP ratones transgénicos, y permitir imágenes repetidas de la regeneración de axones más de 4 cm en el SNP y la interacción axón con la interfaz del sistema nervioso central.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...