Name: live imaging of dorsal root axons after rhizotomy
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy at JoVE.com

Vi tackar Dr Alan Tessler för kommentarer och redaktionellt hjälp. Detta arbete stöddes av NIH NS062320.

1. Mikroskop ställa in och bildhantering förberedelse <ol><li> Vår avbildning inrättat består av en Leica MZ16 fluorescerande stereomikroskop med en snabb slutare och en kyld CCD-kamera som styrs av metamorfa programvara. </li><li> Förbered en termostatreglerad värmedyna och anpassa produktionen till 32,5 ° C för att upprätthålla djurets kroppstemperatur under och efter operation. </li><li> Varm steril Ringers lösning eller konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) till 32,5 ° C i förväg för bevattning av...

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

Imaging DR förnyelse direkt i levande möss är särskilt utmanande eftersom det kräver en avsevärd rygg laminektomi att övervaka axon tillväxt över ett stort område följt av flera invasiva kirurgiska och anestesi i efterföljande bildbehandling sessioner. Flera strategier hjälpte till att övervinna dessa utmaningar. Först lyckade avbildning krävs att minska musen dödlighet (cirka 25%) genom att minimera den tid som anestesi och blödning, och genom noggrann post-op vård. Dödligheten minskade också med h...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> H line thy1-YFP (2-4 månader gamla, båda könen) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003.782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (AnaSed injektion, steril lösning) </td><td> Lloyd Laboratories (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketamin hydroklorid injektion, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorfin (Buprenex injicerbara) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Små djur hårklippningsmaskiner </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Hårborttagning lotion </td><td> Church &amp; Dwight Co (Princeton, NJ) </td><td> Nair med babyolja </td><td></td></tr><tr><td> Slingervävnader svampar </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Bomullspinne kompresser </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14-960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml sprutor </td><td> Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, New Jersey) </td><td> 309.602 </td><td></td></tr><tr><td> Subkutan (sub-Q) nålar, 26ga. </td><td> Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, New Jersey) </td><td> 305.115 </td><td></td></tr><tr><td> Våren sax och pincett </td><td> Fine Science Tools, (Foster City, Kalifornien) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5-mm böjd rongeurs </td><td> Fine Science Tools, (Foster City, Kalifornien) </td><td> 16.221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-laktat injektionsvätska USP </td><td> B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Steril koksaltlösning </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918.610 </td><td></td></tr><tr><td> Tunn syntetisk matris membran (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Konstgjord dura </td><td> Gore Förhindra MVP Dura suppleant, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 silke suturer </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Sår klipp </td><td> Perfekt - Ets Bruneau, (Burnea, Frankrike) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerande stereomikroskop </td><td> Leica Microsystems (Wetzlar, Tyskland) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur Controller </td><td> World precisionsinstrument (Sarasota, FL) </td><td> ATC-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorfa programvara </td><td> Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, Kalifornien </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Den primära sensoriska axoner skadas av ryggmärgen rot skador misslyckas med att regenerera in i ryggmärgen, vilket leder till kronisk smärta och permanent känselbortfall. Förnyelse av dorsala (DR) axoner i ryggmärgen hindras på dorsala posten zon (DREZ), gränssnittet mellan CNS och PNS. Vår förståelse av de molekylära och cellulära händelser som hindrar förnyelse i DREZ är ofullständig, delvis på grund av komplexa förändringar i samband med nervskada har härledas från döden analyser. Dynamisk cellulära processer, såsom axonet förnyelse, är bäst studeras med metoder som fångar upp händelser i realtid med flera observationer av varje levande djur. Vår förmåga att övervaka nervceller serie in vivo har ökat dramatiskt på grund av revolutionerande innovationer inom optik och mus transgena. Flera rader av thy1-GFP transgena möss, där grupper av nervceller genetiskt märks i olika fluorescerande färger, tillåta enskilda nervceller som ska avbildas in vivo 1. Dessa möss har använts i stor utsträckning för in vivo avbildning av muskel 2-4 och hjärnan 5-7, och har gett nya insikter i fysiologiska mekanismer som statiska analyser inte kunnat lösas. Imaging studier av nervceller i levande ryggmärgen har först nyligen börjat. Lichtman och hans kollegor visade först deras genomförbarhet genom att spåra skadade dorsal kolumn (DC) axoner med brett fält mikroskopi 8,9. Multi-photon in vivo avbildning av djupt placerade DC axoner, har mikroglia och blodkärl också gjorts 10. Under de senaste åren har vi banat väg att tillämpa in vivo imaging att övervaka förnyelse av DR axoner med brett fält mikroskopi och H linje thy1-YFP möss. Dessa studier har lett oss till en roman hypotes om varför DR axoner hindras från att återskapa i ryggmärgen 11. I H linje thy1-YFP möss, är separata YFP + axoner ytligt placerade, vilket gör att flera axoner som skall övervakas samtidigt. Vi har lärt oss att DR axoner anländer till DREZ bättre avbildas i ländryggen än i cervikala ryggmärgen. I föreliggande rapport beskriver vi flera strategier som vi har funnit användbara för att säkra framgångsrika långsiktiga och upprepade avbildning av regenererande DR axoner. Dessa inkluderar metoder som eliminerar upprepade intubation och respiratoriska avbrott, minimera kirurgi-associerade stress och ärrbildning, och förvärva stabila bilder med hög upplösning utan fototoxicitet.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy at JoVE.com

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

En<em&gt; In vivo</em&gt; Bildprotokoll att övervaka primära sensoriska axoner efter dorsala krossa beskrivs. De förfaranden som utnyttjar brett fält fluorescensmikroskopi och thy1-YFP transgena möss, och tillåta upprepad avbildning av Axon förnyelse över 4 cm i PNS och interaktion axon med gränssnittet i CNS.

Live avbildning av dorsala Axoner efter Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Kromatin Immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsala ganglion Injection och dorsala krosskada som en modell för Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsalrotsganglier ganglier isolering och primära kultur att studera neurotransmitterfrigöraren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Spektral Reflectometric mikroskopi på myeliniserade axoner In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Utredande däggdjur Axon regenerering: In Vivo elektroporation av vuxen mus dorsalrotsganglier Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Snabb isolering av dorsala root ganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Myelinisering in vitro av perifera axoner i en samkultur av råtta dorsalrotganglion explantat och Schwannceller

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Anrikning av vuxna musdorsala rotganglier neuronkulturer genom immunpanorering

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...