Name: imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum at JoVE.com

Эта работа проводится при поддержке очной фонд из NIAID, NIH.

1. Подготовка хемотаксиса компетентные клетки discoideum Dictyostelium <ol><li> Для создания Д. discoideum клетки, которые хемотаксиса к хемоаттрактант цАМФ, урожай клеток, растущих в D3-T мультимедийных от тряски культуры при 22 ° C. </li><li> Вымойте клетки дважды в непитательных развития буфера (DB буфера, ?...

<ol>
	<li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis.">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li><li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors.">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li><li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium.">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li><li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method.">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li><li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing.">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li><li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis.">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li><li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells.">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li><li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphatidylinositol+3'+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium.">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction.">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li><li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt/PKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium.">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 .</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells.">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis.">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients.">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li><li>Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li></ol>

Процессы идущие хемотаксиса компетентных этапе клетки Для дикого типа D. discoideum клетки, она занимает около 5 ~ 6 часов пульсирующий развития при комнатной температуре, чтобы побудить их в хорошо хемотаксиса компетентных стадию, при которой клетки дисплей хорошо поляри?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> D3-T Медиа роста </td><td> К. Д. Медицинские </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Кофеин </td><td> Сигма </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Молекулярные зонды </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Молекулярные зонды </td><td></td><td></td></tr><tr><td> цАМФ </td><td> Сигма </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT программируемый таймер </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 перистальтического насоса </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Платформа роторном шейкере </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet микрокапиллярных давление питания </td><td> Эппендорф </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Одно-и четырех-и Lab-Tek II покровного стекла камеры </td><td> Nalge Nunc Международной </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META или эквивалент флуоресцентного микроскопа </td><td> Zeiss </td><td></td><td> 40X 1,3 НС или 60X 1,4 Н. А. масла ДВС План-Neofluar объектива </td></tr><tr><td> Olympus X81 или эквивалент </td><td> Олимп </td><td></td><td> Требуется 100X 1,47 NA TIRF объектив </td></tr></tbody></table>

imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum

Многие эукариотических клетках может обнаружить градиенты химических сигналов в своей среде и мигрировать соответственно 1. Это руководствоваться миграции клеток называется как хемотаксис, что очень важно для различных клеток для выполнения своих функций, таких как торговля иммунных клеток и структурирование нервных клеток 2, 3. Большое семейство G-белком рецепторы (GPCR) обнаруживает переменную небольшие пептиды, известные как хемокины, направить миграции клеток в естественных условиях 4. Конечной целью исследования хемотаксиса чтобы понять, как машины GPCR чувств хемокинов градиенты и контроля сигнализации событий, приведших к хемотаксис. С этой целью мы используем методы визуализации для мониторинга в режиме реального времени, пространственно-временной концентрации хемоаттрактантов, сотовые движения в градиенте хемоаттрактант, GPCR опосредованной активации гетеротримерные G-белком, и внутриклеточных сигнальных событий, участвующих в хемотаксис клеток эукариот 5-8 . Простой эукариотических организмов, Dictyostelium discoideum, отображает chemotaxic поведения, которые аналогичны тем, лейкоцитов и D. discoideum является ключевым модельной системой для изучения эукариотических хемотаксис. Как свободно живущих амеб, Д. discoideum клетки делятся в богатой среде. После голода, клетки вступают программа развития, в котором они совокупный через цАМФ-опосредованной хемотаксис сформировать multicullular структур. Многие компоненты, участвующие в хемотаксис в лагерь были определены в D. discoideum. Связывание цАМФ с GPCR (car1) индуцирует диссоциации гетеротримерные G-белков в Gγ и Gβγ подразделения 7, 9, 10. Gβγ подразделения активировать Ras, который, в свою очередь, активирует PI3K, превращая PIP PIP 2 в 3 на клеточной мембране 11-13. PIP 3 служат сайты связывания белков с pleckstrin Гомология (PH) доменов, таким образом, набор этих белков с мембраной, 14, 15. Активация рецепторов car1 также контролирует мембраны объединений PTEN, который dephosphorylates PIP PIP 3 до 2 16, 17. Молекулярные механизмы эволюционно консервативных в хемокинов GPCR-опосредованной хемотаксис клеток человека, такие как нейтрофилы 18. Мы представляем следующие методы исследования хемотаксиса D. discoideum клеток. 1. Подготовка хемотаксиса клетки компонента. 2. Изображений хемотаксис клеток в цАМФ градиента. 3. Мониторинг GPCR индуцированной активации гетеротримерные G-белка в одном живых клеток. 4. Изображений хемоаттрактант запускаемой динамических PIP 3 ответов в одном живых клеток в реальном времени. Наши разработанные методы визуализации могут быть применены для изучения хемотаксиса лейкоцитов человека.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum at JoVE.com

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Здесь мы описываем подробные изображения живой клетки методы исследования хемотаксиса. Мы представляем флуоресценции микроскопических методов контроля пространственно-временной динамике сигнальных событий в мигрирующих клетках. Измерение сигнальных событий позволяет нам понять, как дальше GPCR-сети сигнализации достигает градиент зондирования хемоаттрактантов и контролирует направленного миграции эукариотических клеток.

Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Количественная агонистично активность на G-белком рецепторы

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Живых изображений сотовый событий раннего этапа Аутофагия: Omegasomes и на последующий период

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Характеристика G-белком с помощью флуоресцентной основе кальция мобилизации Пробирной

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Визуализация клатрином эндоцитоза из G-белками в Single-событий резолюции через TIRF микроскопии

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Агрегацией Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Обработки изображений G-белком рецептор-опосредованный хемотаксис и его сигнальных событий в нейтрофилами как клетки HL60

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Изучение белка качества системы управления<em&gt; D. discoideum</em&gt; Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...