Name: an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00
Duration: 12 min 18 s
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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni USDA 1999-35212-8680, 2005-01378, e 2010-04288-01, USDA Fondi Formula e dello Stato della Georgia di Medicina Veterinaria di Grant ricerca agricola. Il protocollo descritto in questa pubblicazione è stata sviluppata per l&#39;uso da studenti universitari come parte di corsi di ricerca diretto: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L e 4960H BIOL presso l&#39;Università della Georgia e utilizzate dagli studenti su progetti diversi epidemiologia molecolare di ricerca nel Maurer laboratorio. Desideriamo ringraziare i numerosi studenti universitari che hanno svolto attività di ricerca in Maurer e laboratori Lee, e il nostro reparto di sedia, John Glisson per supportare i nostri sforzi per integrare l&#39;istruzione universitaria con la ricerca.

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	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La maggior parte dei test disponibili in commercio PCR per l&#39;individuazione dei geni Salmonella obiettivi unici al genere (es. invasioni). Tuttavia, non tutti Salmonella sono uguali nella loro capacità di causare malattie nell&#39;uomo o prevalenza nelle popolazioni animali. Il riconoscimento precoce delle differenze antigeniche in Salmonella LPS O-antigene e flagellinH1 e gli antigeni H2 ha portato alla differenziazione di Salmonella in oltre 2.500 sierotipi sulla base di queste differenze antigeniche. Ci sono 46 diversi antigeni O e 86 distinte flagellina (H) antigeni identificati nel genere Salmonella. Salmonella può possedere uno (H1) o due diversi (H1 e H2) flagellins. La diversa combinazione di O, H1 e H2 conto antigeni per i sierotipi di Salmonella 2.500 riconosciuto oggi. Un sierotipo viene assegnato sulla base della formula antigenica derivato dalla identificazione dei singoli antigeni O e H. La formula antigenica è scritto come O: H1: H2, e dove &quot;-&quot;, si riferisce all&#39;assenza di H1 o H2 flagellina e &quot;NT&quot; (non tipizzabile) per la salmonella negativo per l&#39;O-antigene. Ad esempio, il sierotipo Typhimurium è assegnato ad una S. enterica isolare con la formula antigenica B: i: 1,2 mentre Enteritidis è dato a un isolato con la formula D1: g, m: -. Questa variazione antigenica nella popolazione Salmonella è la manifestazione esteriore delle differenze a livello di nucleotidi che possono quindi essere facilmente sfruttato da PCR. Abbiamo identificato le differenze genetiche associate con specifici alleli O e H di sviluppare un allelotyping PCR per l&#39;individuazione S. enterica sierotipi: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (3). La corretta assegnazione e la segnalazione di Salmonella serovar richiede test per tutti gli alleli associati a O: H1: formule antigeniche H2 per Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), e Typhimurium (B: i: 1,2). Senza la conoscenza della allele O o antigene, il ritrovamento del g H1, allele m da solo non necessariamente identificare il isolare Salmonella Enteritidis come come gli altri sierotipi di Salmonella: Agona, California, e Montevideo, anche in possesso di questo stesso allele. Mentre la PCR allelotyping è stato originariamente progettato per rilevare il succitato sierotipi di Salmonella, questo test può identificare un ulteriore periodo di 19 sierotipi (Tabella 3). Il nostro allelotyping PCR è stato originariamente progettato per rilevare gli alleli O e H. In pratica, è diventato più pratico e conveniente per di identificare l&#39;O-antigene mediante test di agglutinazione su vetrino, con O-specifici antisieri, anziché eseguire l&#39;O allelotyping PCR quando si lavora con le culture Salmonella isolati. Tuttavia, si sconsiglia l&#39;uso del O allelotyping PCR se il laboratorio utilizza questo PCR come uno schermo (2) o per la tipizzazione isolati di Salmonella presentato in sede di FTA carte (6), e comprendono una Salmonella specifico PCR con la prima schermata dei campioni (4 ). Limitare la PCR allelotyping solo a quei campioni che sono identificati come Salmonella mediante PCR o test biochimici / antigenica. Il protocollo descritto in questo articolo è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo con la tecnologia Idaho Rapidcycler, ad aria calda termociclatore che permette di far ridurre la quantità di reazione e le condizioni di reazione viene eseguito in meno tempo di quanto molti termociclatori blocco riscaldante. Per adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un termociclatore blocco riscaldante può richiedere l&#39;ottimizzazione delle condizioni di reazione empiricamente abbassando / alzando la temperatura di ricottura; regolare le concentrazioni di fondo, oppure regolando MgCl2 concentrazioni. Per esempio, abbiamo dovuto adattare il protocollo per la Ricerca MJ termociclatore PTC-200 come segue. Lavorare con i volumi stessa reazione descritta nella tabella 1, lo stock di lavoro concentrationof è stato diluito il set fondo ho a 2,5 micron, la temperatura di annealing è stata abbassata da 55 ° C a 45 ° C, e tempi di incubazione alla denaturazione, appaiamento ed estensione passi è stato allungato a 20 s per i / g, m allelotyping PCR. Avendo gli opportuni controlli positivi e negativi sono essenziali nella start up iniziale e di ottimizzazione per qualsiasi PCR, inclusi i protocolli pubblicati. Si consiglia di acquisire i sierotipi di Salmonella noto, in particolare Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) e Typhimurium (B: i: 1,2), e un laboratorio di Escherichia coli K12 ceppo (DH5α, LE393, JM109, ecc ) come controlli positivi e negativi rispettivamente per il test PCR allelotyping descritto in questo articolo. Molti di questi sierotipi di Salmonella serviranno come controlli positivo o negativo, a seconda di quale allele è testato. Alcune precauzioni e le linee guida devono essere seguite durante l&#39;esecuzione di questo e qualsiasi altra diagnostico PCR. In primo luogo, la separazione fisicadi preparazione modello, PCR set-up, e l&#39;elettroforesi su gel è fondamentale nel prevenire possibili PCR riporto contaminazione e segnalazione erronea di falsi positivi. Inoltre, l&#39;inclusione di controlli adeguati è necessario in ogni routine PCR come questi controlli identificare i problemi che si presentano e facilitare l&#39;interpretazione dei risultati (5). Più importante, la coerenza è fondamentale, soprattutto per quanto riguarda le condizioni elettroforetica per amplicone (PCR prodotto) andestimation rilevamento di dimensioni amplicone. Per illustrare questo punto, abbiamo volutamente sospeso elettroforesi prima di quanto previsto nella Figura 1A. Gli standard di peso molecolare (corsie 1 e 13) e il controllo positivo (corsia 2) non sono sufficientemente separati da stimare con precisione le dimensioni o osservare la separazione di frammenti di DNA dove ci sono piccole differenze (~ 50 pb) in dimensioni. Un&#39;adeguata separazione di frammenti di DNA, in particolare gli standard di peso molecolare, è essenziale come report positivi dipende stima accurata della dimensione amplicone e distintivi &quot;vero positivo&quot; da non specifici ampliconi che vengono a volte osservata nella gestione quotidiana di una PCR (5 ). Ad esempio, vi è un non-specifico amplicone in Figura 1B, corsia 7 (~ 700 bp nel formato). Aveva elettroforesi stato interrotto troppo presto, quando il fronte del colorante è stato solo nel punto a metà strada nel gel di agarosio, ci sarebbero differenze sono minime tra i 500 bp e 700 bp frammenti di DNA. Pertanto, campione in corsia 7 sarebbe stato erroneamente riportato come positivo sia per i e g, m alleli. Infine, bisogna riconoscere i limiti associati a qualsiasi prova. Molti dei allelotyping H1/H2 PCR non hanno il potere discriminatorio di discernere sottili differenze genetiche in alleli appartenenti al H2 1,2; 1,5, 1,6, 1,7 complesso antigene, e, n, x / e , n, Z15 complesso antigene e l&#39;antigene H1 G complesso, che comprende l&#39;, allele g m. Uno o due cambiamenti di aminoacidi rappresentano gli epitopi diversi presenti in questi antigeni flagellari. Era quindi difficile per noi a progettare primers in grado di sfruttare queste differenze a volte singolo paia di basi della sequenza del gene flagellina (3). Per esempio, sierotipi di Salmonella Dublin (D1: g, p: -) e Berta (D1: f, g, t: -) sono positivi alla PCR con la nostra g, mallelotyping primer. I primer allelotyping H2 non può distinguere Typhimurium (B: i: 1,2) da Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) da Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), o Remo (B: r: 1,7), o Hadar (C2: Z10: e, n, x) da Glostrup (C2: Z10: e, n, Z15). Mentre la probabilità di incontrare alcuni di questi sierotipi: Lagos, Bradford, Winneba, Remo o Glustrup è remoto, è una possibilità e richiede uno provvedendo disclaimer sulla limitazione dei test &#39;o in un altro test di conferma. In conclusione, questo PCR-based sierotipizzazione identifica rapidamente S. enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium, e O, H1, H2 e gli alleli associati con 19 sierotipi aggiuntivi. Questo test è un rapido e conveniente alternativa al tradizionale approccio microbiologico sierotipizzazione di Salmonella.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commento </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Provette per microcentrifuga </td><td> 1,5 ml di capacità </td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> 200 prova </td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Biologia Molecolare Grado </td><td> Sigma </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabile; PCR solo) </td></tr><tr><td> 10 x PCR buffer </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td> (Buffer viene fornito con BSA, Ficoll e Tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primer </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Pipette capillari </td><td> Un volume di 10 microlitri </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rapido Cycler </td><td></td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Bassa EEO; Grado Biologia Molecolare </td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> 50 X TAE tampone o buffer TBE 5X </td><td></td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Bromuro di etidio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Orizzontale, sommersi gel elettroforesi da camera con muffa gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Alimentazione </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc sistema </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Materiale

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Gli attuali test commerciale PCR per l&#39;identificazione dei geni bersaglio Salmonella unica di questo genere. Tuttavia, ci sono due specie, sei sottospecie, e oltre 2.500 diversi sierotipi di Salmonella, e non tutti sono uguali nel loro significato per la salute pubblica. Per esempio, trovare S. enterica sottospecie IIIa Arizona in una fattoria strato tavolo uovo è insignificante rispetto all&#39;isolamento di S. sottospecie enterica sierotipo Enteritidis I, la principale causa di salmonellosi legato al consumo di uova da tavola. Sierotipi sono individuati sulla base di differenze antigeniche in lipopolisaccaride (LPS) (antigene O) e flagellina (H1 e H2 antigeni). Queste differenze antigeniche sono l&#39;aspetto esteriore della diversità dei geni e alleli del gene associata a questo fenotipo. Abbiamo sviluppato un allelotyping, PCR multiplex che le chiavi sulle differenze genetiche tra i quattro maggiori S. sottospecie enterica sierotipi che ho trovato nel pollame e associata a gravi malattie umane negli Stati Uniti. Le coppie di primer PCR sono stati mirati a geni chiave o sequenze uniche ad un sierotipo di Salmonella specifiche e destinate a produrre un amplicone con dimensioni specifiche per quel gene o allele. Salmonella sierotipo viene assegnato a un isolato basata sulla combinazione dei risultati dei test PCR per LPS specifico e flagellina alleli del gene. La PCR multiplex descritto in questo articolo sono specifici per la rilevazione di S. enterica sottospecie I sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Qui mostriamo come utilizzare il PCR multiplex per identificare un sierotipo di Salmonella isolare.

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Descriviamo un multiplex PCR per la rilevazione rapida di Salmonella enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sierotipi di Salmonella specifici possono essere identificati prendendo di mira un multiplex PCR di geni e sequenze uniche per l&#39;O-antigene grappolo biosintesi e flagellina di un sierotipo dato. Sierotipo viene assegnato poi a isolare Salmonella in base alla comparsa di specifiche, ampliconi dimensioni (prodotto PCR) corrispondente al allele di destinazione.

Un Allelotyping PCR per l&#39;identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

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