Name: profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen R01DA021194 en R01NS058850.

1. Brain slice voorbereiding <ol><li> Jonge (15-40 dagen oud) mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten worden gebruikt. (We gebruiken deze zelfde protocol bij muizen.) Onder diepe narcose urethaan, zijn dieren onthoofd en de hersenen is snel ontleed uit. Dan 300 micrometer dik coronale hersenen plakken met de midrostral deel van substantia nigra worden gesneden op een Leica vibratome (VT-1200S). De slice snijden procedure wordt uitgevoerd in een ijskoude, zuurstofrijke hoge sucrose snijden oplossing die (in mm)...

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

De combinatie van patch clamp opnamen in de hersenen slice met scRT-PCR toonden we hier een uitstekende methode om de mRNA-expressie-profielen te onderzoeken voor de ion kanalen, receptoren, en de belangrijkste enzymen voor neurotransmitters synthese in individueel gekarakteriseerd neuronen. Dit is vooral handig wanneer het eiwit in kwestie niet kan worden gedetecteerd en gelokaliseerd met behulp van andere methoden zoals immunohistochemie te wijten aan lage expressie-niveau en / of gebrek aan geschikte antilichaam (Sur...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabel 1" /> Tabel 1. Key reagentia en apparatuur <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabel 2" /> Tabel 2. Primer paar voor rat neuronale KV3 kanaal, tyrosine hydroxylase (TH) en glutaminezuur decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNA&#39;s voor scRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

In centrale zenuwstelsel, zijn verschillende soorten neuronen met verschillende moleculaire en functionele eigenschappen vermengd met elkaar, moeilijk te scheiden en ook niet gemakkelijk te herkennen aan hun morfologie. Zo is het vaak moeilijk om genexpressie te analyseren in een specifiek neuron type. Hier hebben we een document procedure die whole-cell patch clamp opnamen technieken combineert met een single-cell reverse transcriptie polymerase chain reaction (scRT-PCR) naar het profiel van mRNA expressie in verschillende types van neuronen in de grote nigra. Elektrofysiologische technieken worden voor het eerst gebruikt om de neurofysiologische en functionele eigenschappen van individuele neuronen te nemen. Dan is het cytoplasma van een elektrofysiologische gekenmerkt nigral neuronen afgezogen en onderworpen aan scRT-PCR-analyse mRNA-expressie profielen te verkrijgen voor neurotransmitters synthese enzymen, receptoren en ionkanalen. De hoge selectiviteit en gevoeligheid maakt deze methode met name handig als immunohistochemie kan niet te wijten aan een gebrek aan geschikte antilichaam of lage expressie-niveau van het eiwit worden gebruikt. Deze methode is ook toepasbaar op neuronen in andere hersengebieden.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA&#39;s voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.

Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...