Name: profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01DA021194 und R01NS058850 unterstützt.

1. Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Junge (15-40 Tage alt) männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten verwendet. (Wir verwenden auch diese gleiche Protokoll bei Mäusen.) Unter tiefen Urethannarkose, sind Tiere geköpft und das Gehirn ist schnell herauspräpariert. Dann werden 300 Mikrometer dicke koronalen Hirnschnitten mit den midrostral Teil der Substantia nigra sind auf einer Leica Vibratom (VT-1200S) geschnitten. 220 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaC...

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Die Kombination von Patch-Clamp-Aufzeichnung in Hirnschnitt mit SCRT-PCR haben wir gezeigt, hier bieten eine hervorragende Methode, um die mRNA-Expression-Profile für Ionenkanäle, Rezeptoren und Schlüsselenzyme für Neurotransmittersynthese in individuell charakterisiert Neuronen zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, wenn das Protein in Frage nicht erkannt und lokalisiert werden mit anderen Methoden wie Immunhistochemie durch niedrige Expression und / oder mangels geeigneter Antikörper (Surmeier et al 1996;....

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Key Reagenzien und Geräte <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 2. Primerpaare für Ratten neuronalen Kv3 Kanal, Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Glutaminsäure Decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNAs für SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

In zentralen Nervensystem von Säugetieren, sind verschiedene Typen von Neuronen mit verschiedenen molekularen und funktionellen Eigenschaften miteinander, nur schwer zu trennen und auch nicht einfach durch ihre Morphologie identifiziert vermischt. So ist es oft schwierig, die Genexpression in einem bestimmten Neuron Art zu analysieren. Hier dokumentieren wir ein Verfahren, whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmetechnik kombiniert mit Single-Cell-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (SCRT-PCR) zum Profil mRNA-Expression in verschiedenen Typen von Neuronen in den wesentlichen nigra. Elektrophysiologische Techniken werden zuerst auf die neurophysiologischen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Nervenzellen aufnehmen. Dann wird das Cytoplasma einzelner elektrophysiologisch charakterisiert nigral Neuronen abgesaugt und einer SCRT-PCR-Analyse zur mRNA-Expression-Profile für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Rezeptoren und Ionenkanäle erhalten. Die hohe Selektivität und Sensitivität machen diese Methode besonders nützlich, wenn Immunhistochemie nicht aufgrund eines Mangels an geeigneten Antikörper oder niedrige Expression des Proteins verwendet werden. Diese Methode ist auch anwendbar auf Neuronen in anderen Hirnregionen.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...