Name: profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01DA021194 e R01NS058850.

1. Preparação fatia do cérebro <ol><li> Jovens (15-40 dias de idade) do sexo masculino e feminino Sprague-Dawley são usados. (Nós também usamos esse mesmo protocolo em camundongos.) Sob anestesia profunda de uretano, os animais são decapitados eo cérebro é rapidamente dissecados. De 300 m de espessura fatias do cérebro que contém a parte coronal midrostral da substantia nigra são cortados em um vibratome Leica (VT-1200S). A fatia de corte procedimento é realizado em uma gelada, sacarose oxigenado alta cor...

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

A combinação de gravação de patch-clamp na fatia do cérebro com SCRT-PCR demonstramos aqui fornecem um excelente método para investigar os perfis de expressão de RNAm para canais iônicos, receptores e enzimas-chave para a síntese de neurotransmissores nos neurônios individualmente caracterizado. Isso é particularmente útil quando a proteína em questão não podem ser detectadas e localizadas através de outros métodos, tais como imunohistoquímica, devido ao nível de baixa expressão e / ou falta de antic...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Reagentes e equipamentos chave <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabela 2" /> Tabela 2. Pares de primers para rato canal Kv3 neuronal, tirosina hidroxilase (TH) e descarboxilase do ácido glutâmico 1 (GAD1) ​​mRNAs para SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

No sistema central de mamíferos nervoso, diferentes tipos de neurônios com diversas características moleculares e funcionais são misturados uns com os outros, difícil separar e também não são facilmente identificados pela sua morfologia. Assim, é muitas vezes difícil de analisar a expressão de gene em um tipo de neurônio específico. Aqui nós documentamos um procedimento que combina de célula inteira correção técnicas de gravação de fixação com uma única célula reverter reação em cadeia da polimerase (SCRT-PCR) para expressão de mRNA perfil em diferentes tipos de neurônios no nigra substancial. Técnicas eletrofisiológicas são utilizados pela primeira vez para registrar as propriedades neurofisiológicas e funcionais de neurônios individuais. Então, o citoplasma de uma única eletrofisiologicamente caracterizada neurônios da substância negra é aspirado e submetido a SCRT-PCR para obter perfis de expressão de RNAm para as enzimas de síntese de neurotransmissores, receptores e canais iônicos. A alta seletividade e sensibilidade tornam este método particularmente útil quando imunohistoquímica não pode ser usado devido à falta de anticorpos adequado ou baixo nível de expressão da proteína. Este método também é aplicável aos neurônios em outras áreas do cérebro.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...