Name: profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01DA021194 och R01NS058850.

1. Brain skiva förberedelse <ol><li> Unga (15-40 dagar gammal) manliga och kvinnliga Sprague-Dawley används. (Vi använder samma protokoll i möss.) Enligt djupt uretan anestesi, är djur halshuggen och hjärnan snabbt dissekeras ut. Sedan 300 um tjock koronalt hjärnan skivor som innehåller midrostral del av substantia nigra skärs på en Leica vibratome (VT-1200-talet). Segmentet skärande proceduren utförs i en iskall, syresatt hög sackaros lösning för kapning som innehåller (i mm): 220 sackaros, 2,5 KCl, 1...

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Kombinationen av patch clamp inspelning i hjärnan skiva med SCRT-PCR vi visat här ger en utmärkt metod för att undersöka profilerna mRNA uttryck för jonkanaler, receptorer och viktiga enzymer för neurotransmittorn syntes i individuellt präglas nervceller. Detta är särskilt användbart när proteinet i fråga inte kan upptäckas och lokaliseras med hjälp av andra metoder såsom immunohistokemi på grund av låg uttryck nivå och / eller brist på lämpliga antikropp (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). De...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabell 1" /> Tabell 1. Key Reagenser och utrustning <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabell 2" /> Tabell 2. Primerpar för råtta neuronala KV3 kanal, tyrosin hydroxylas (TH) och glutaminsyradekarboxylas 1 (GAD1) ​​mRNA för SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

I däggdjur centrala nervsystemet, är olika typer av nervceller med olika molekylära och funktionella egenskaper blandas med varandra, svårt att separera och inte heller lätt identifieras genom sin morfologi. Därför är det ofta svårt att analysera genuttryck i en viss nervcell typ. Här dokumenterar vi en procedur som kombinerar helcells-patch tekniker klämma inspelning med encelliga omvänd transkription polymeraskedjereaktion (SCRT-PCR) för att profilera mRNA uttryck i olika typer av nervceller i stora nigra. Elektrofysiologiska tekniker är först används för att registrera neurofysiologiska och funktionella egenskaper hos enskilda nervceller. Då är cytoplasman av enstaka elektrofysiologiskt kännetecknas nigral nervceller aspirerade och utsätts för SCRT-PCR-analys för att få profiler mRNA uttryck för enzymer neurotransmittor syntes, receptorer och jonkanaler. Den hög selektivitet och hög känslighet gör denna metod särskilt användbar när immunohistokemi inte kan användas på grund av brist på lämpliga antikroppar eller låg uttryck nivån av proteinet. Denna metod är också tillämplig på nervceller i andra områden i hjärnan.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neuroner är första kännetecknas elektrofysiologi. Då cytoplasman från den inspelade neuron sugs och utsätts för omvänd transkription-PCR-analys för att upptäcka uttryck för mRNA för enzymer neurotransmittorer syntes, jonkanaler och receptorer.

Profilering spänningskänsliga Kalium Expression Kanal mRNA i Nigral nervceller med hjälp av encelliga RT-PCR-teknik

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Inspelning Ljus framkallade Postsynaptiska svar i nervceller i Dark-anpassade, mus näthinnan Slice Förberedelser Använda Patch Clamp Tekniker

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Tillförlitlig identifiering av Living dopaminerga neuroner i mellanhjärnan kulturer Använda RNA sekvensering och TH-promotor-driven EGFP uttryck

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Att göra och testning med kalium Ion selektiv mikroelektroder i vävnad skivor av vuxna hjärnan

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Single-cell RNA-sekvensering av Fluorescently märkt mus nervceller med manuell sortering och dubbel In Vitro transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Encellig elektroporering över olika organotypiska slicekultur av mus hippocampal excitatorisk och klassspecifik hämmande nervceller

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...