Name: in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion
Uploaded: 2011-11-10T12:00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Paul Weigel ved Univ.. i Oklahoma for brug af monoklonale antistof 30 for påvisning af HARE/Stabilin-2 receptoren og Janet Weigel for hendes teknisk bistand. Denne forskning er finansieret af University of Nebraska forskningsmidler.

1. Excision af leveren (adopteret fra PO Seglen 12 og R. Blomhoff 13 med modifikationer 14,15) <ol><li> Tilsæt 10 mL 30% isofluran i polyethylenglycol til en petriskål i et lukket 5,5 L kammer. Det er optimalt at vente 10-15 minutter efter tilsætning af isofluran til at skabe en stabil atmosfære i kammeret. </li><li> Placer en rotte i den forseglede kammer og lade den blive bedøvet. Fulde effekt af anæstesi er tydelige, når dyret bliver slatne, reagerer, og udviser dyb vejrtrækning. </li><li> Læg 2 mL isofluran hos polyethylenglycol i nogle vatkugler i bunden af ​​en 30 ml sprøjte rør. </li><li> Placer rotte på ryggen på en ble-dækket bakke og læg sprøjten røret over snuden. </li><li> Umiddelbart bekræfter dyb anæstesi ved fugte maven med 70% ethanol. Lad ikke dyret dø af isofluran overdosis. </li><li> Brug af bandage saks og pincet, hele abd udsættesominal hulrum. </li><li> Find Vena Porta og ved hjælp af pincet, tegne to dele af kirurgisk silke eller polyester tråd (ligatur) under vena porta umiddelbart over mesenteriallymfeknuderne gren. </li><li> Træk pincet og binde en løs overhånd knude. </li><li> Brug pincet under Vena Porta og forsigtigt at trække tilbage til rette ud venen, venen cannulate med en Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) eller lignende kateter. Kateteret skal gå flere mm ud over sløjfen dannet af tråd. </li><li> Træk og fjern nålen ved at slippe fjederbelastede aftrækkeren på kateteret. Blod skal starte siver op i kateteret angiver en korrekt ligatur placering. </li><li> Stram ned overhånd knude og fastgør det med et andet overhånd knude. </li><li> Sever enten ringere vena cava eller faldende hovedpulsåren (aorta abdominalis), så blodet dryppe ud af kredsløbet. </li><li> Begynd rødmen leveren med iltetTBS ved 37 ° C for at fjerne blodet (blanchering) ved en flowhastighed på 20 ml / min. Leveren skal dreje fra en rødlig lilla til en loam farve. </li><li> Mens leveren er rødmen, punktafgifter leveren ved at skære væk mave-tarmkanalen og bindevæv. Det er vigtigt ikke at lacerate leveren eller punktere Glisson i kapslen. </li><li> Placer leveren på et plastik net over en tragt, der tillader buffere, der skal indsamles og recirkuleres. Buffere på dette punkt bør ikke recirkuleres, men løber ud i affald bægerglasset. Flushing bør ikke vare mere end 10 min. (Fig. 2A). Forbered endocytose løsning kræves i trin 2.1. </li></ol> 2. Internalisering af 125 I-SA-b-Hep (eller andre egnede mærkede ligand) <ol><li> Til 50 ml RPMI medier i et lille bægerglas, til en endelig koncentration 0,05% BSA og 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep eller anden behørigt mærket ligand for endocytose tilføje. </li><li> Vedhæft denne bægeret til apparatus at give mulighed for iltning. </li><li> Sluk pumpen, tænd fjorden slangen, og derefter tænde for pumpen ved 20 ml / min. </li><li> Da mærkede RPMI nærmer sig leveren, skal du slukke pumpen og lad overskydende væske i tragten og slange afløb. </li><li> Placer drain slangen i medierne bægeret til at tillade recirkulation af mærket medier og derefter genstarte pumpen. </li><li> Tillad væsker til at recirkulere gennem leveren for ikke mere end 1 time. </li><li> I løbet af denne internalisering trin, skal du sørge for at temperaturen i leveren er stabil ved at dække det og forberede collagenase for fordøjelsen. </li></ol> 3. Fordøjelse af leveren ved collagenase fordøjelse <ol><li> Frisk opløst og filtreret (0,45 μm) collagenase (100 mg / kg rotte vægt) bør føjes til Buffer 2 i et samlet volumen ikke overstige 60 ml ved 37 ° C. Lydstyrken er afhængig af længde / indvendige rumfang af slangen og bør justeres i overensstemmelse hermed. </li><li> Stop pumpen og udveksleindløb slange fra medierne bægeret til TBS. </li><li> Skyl leveren i 2 min ved 50 ml / min hvilket giver mulighed for løsning af desmosomal cellens knudepunkter, som er calcium afhængige. </li><li> Mens leveren er rødmen, udveksling medierne bægerglasset med bægerglas, der indeholder collagenase på apparatet. </li><li> Umiddelbart efter skylningen, begynder fordøjelsen med collagenase i en kredsløbssygdomme loop ved en flowhastighed på 20 ml / min i op til 15 min. Siden collagenase partier variere fra lotnummer, variationer i mængden og tidspunktet for fordøjelsen, skal optimeres for hver ny lot collagenase. Collagenase er også calcium afhængig. Sluk for pumpen og skifte buffer og gasledninger fra Kolbe A til Kolbe B. Overfør spildevand linje fra affaldsbeholderen til kolbe b (Fig. 2B). </li><li> Stop pumpen, fjernes kateteret og overføre leveren til en ret, som indeholder 20-30 ml buffer 1. </li><li> Skræl tilbage Glisson er kapslen af ​​leveren og ryste cellens ud i væsken. </li><li> Da væsken bliver uigennemsigtig med cellemateriale, overføre cellerne gennem et 100 mM maske efterfulgt af filtrering gennem en 30 μm mesh og derefter ind i en 50 ml konisk på is. </li><li> Tilføj flere buffer 1 til leveren og fortsætte ryste celler fra leveren matrix, overføre væsken til mesh filtre og konisk. </li><li> Gentag trin fra 3,7 til 3,9, indtil der ikke flere celler, der kan forrykke sig med rimelig ryste i leveren. </li></ol> 4. Hepatocyt og SEK rensning <ol><li> Centrifuger 50 mL conicals indeholdende celler ved 150 xg i 3 min. til pellet i hepatocytter. </li><li> Overfør flydende fraktion, der indeholder ikke-parenkymceller til frisk 50 mL conicals på is. </li><li> Vask hepatocytter skal opblandes pellet i Buffer 3 og gentage trin 4,1 og 4,2 yderligere tre gange. </li><li> Ved afslutningen af ​​den vasker, er de piller ≥ 97% ren hepatocytter. For at opnå den Sek, centrifugeres alle rør Containing poolede supernatant (indeholdende HSCs, Sek, og KCS og nogle små hepatocytter) ved 200 xg i 10 min. ved 4 ° C. </li><li> Aspirer bufferen og resuspender alle de piller i 5 ml RPMI / BSA ved 4 ° C. </li><li> Pool cellerne sammen i 2 rør og tilsæt RPMI / BSA op til en volumen på 35 ml. </li><li> Centrifuger conicals ved 100 xg i 3 min. </li><li> Saml de 25 ml væske og overføres til et rent 50 mL konisk. </li><li> Resuspender pellet i de resterende 10 mL medie og tilføj tilbage 25 ml koldt RPMI / BSA og centrifuger ved 100 xg i 3 min. </li><li> Gentag trin 3,8 og 3,9 gang mere, skal du kassere cellepelleten og nederste 10 ml medier. </li><li> Centrifuger supernatents til pellet Sek, KCS, og HSCs ved 200 xg i 10 min. ved 4 ° C. </li><li> Forbered tre 50 mL rør, der indeholder 20 ml 25% Percoll i PBS på is. Underlag med 15 ml 50% Percoll i hvert rør. </li><li> Resuspender cellen pellets i en samlet volumen på 30 ml RPMI / BSA. </li><li> Forsigtigt overlay EACh gradient med 10 ml af celler og centrifuger ved 900 xg i 20 min ved 4 ° C. </li><li> Sekunder og KCS har meget tætte kraftige tætheder og er på 25/50% interface. HSCs er typisk på 25% / media-interface på grund af deres højere opdrift som lipid opbevaring af celler. Eventuelle resterende hepatocytter og blodlegemer har de lavere buoyancies og piller. Aspirer oppefra og ned tæt på 25/50%, interface og kassér dette materiale. </li><li> Saml cellerne i 25/50% interface og overførsel til en frisk konisk med koldt RPMI. Det endelige volumen skal være ~ 40 ml at fortynde ud Percoll. </li><li> Centrifuger koniske ved 350 xg i 10 min ved 4 ° C til pellet cellerne. </li><li> Cellerne i ~ 10 ml forvarmet RPMI indeholdende 100 E / ml Penicillin/100 g / mL Streptomycin og sted celler i en syre-skyllet glas petriskål eller krystalliserende fad. </li><li> Inkuber cellerne i 15 min. ved 37 ° C i en vævskultur kuvøse. </li><li> Rock eller hvirvel pladen lidtog derefter indsamle de sekunder i supernatant. Den KCS overholder glasset meget hurtigere end sek. Alternativt kan sek være adskilt fra KCS ved immunopurification hjælp af anti-CD31 eller anti-Stabilin2/HARE antistoffer konjugeret til magnetiske perler. </li><li> Levedygtighed og celle tal kan vurderes ved trypan blå udstødelse ved hjælp af en hemacytometer eller med hjælp af et automatisk celletæller. </li><li> Kultur på sek på fibronektin-belagt plast retter ved 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA med 40 ng / ml VEGF, 100 E / ml penicillin, 100 mg / ml Streptomycin eller med hepatocyte betinget medier. </li><li> Hepatocytter, KCS, og Sek kan vurderes, om internalisering af mærket materiale ved brug af en gamma-tæller og normalisere det samlede cellulære protein eller ved mikroskopi (hvis fluorescens-mærkede) ved hjælp af disse dyrkningsundersøgelser. </li></ol> 5. Repræsentative resultater: Hepatocyt rensning er ≥ 97% og SEC rensning er typicallieret ≥ 95% ved hjælp af denne metode. Excision af bughulen, kanylering af portalen vene, og blanchering af leveren alle bør ske inden for et minut for de bedste resultater. HARE/Stabilin-2 er en specifik receptor på leveren Sek og er ikke til udtryk i andre leveren celletyper. I denne prøve blev cellelysater af både hepatocytter og Sek adskilt med 5% SDS-PAGE og probed med et monoklonalt antistof mod både isoformer af Stabilin-2 (Fig. 3). Ufraktioneret heparin sprøjtes ind i blodbanen udskilles via leveren 16. Clearance er primært udført af leveren sekunder i modsætning til hepatocytter og KCS 17. Den Stabilin-2/HARE receptoren er den vigtigste clearance receptoren, der binder og internalizes heparin i sek 18. I vores eksempel her, mærkede vi heparin med biotin tag på carboxylat gruppe af GlcNAc / NS. Den biotin blev konjugeret med jodholdige streptavidin til påvisning af internaliseret heparin proteoglycan. Injektion af mærket heparin efterfulgt af afblødning 30 minutter efter injektion giver os mulighed for at overvåge, hvilke organer internalisere denne form for heparin. I denne korte tidsinterval, er leveren den primære clearance orgel (Fig. 4). Til mere klart at forstå hvilken celletype der er ansvarlig for godkendelse, vi tilføjet 125 I-SA-b-Hep til RPMI medier suppleret med 0,05% BSA og lod den cirkulere gennem leveren i 20 min. Efter collagenase fordøjelsen og cellulære rensning, er det store flertal af mærket heparin internaliseret ved Sek i modsætning til hepatocytter (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Grundlæggende lever arkitektur. Sek udgør væggene i sinusoider og er normalt fenestrated (små klynger af cirkler). Stellate celler (HSCs) findes i løbet af These i modsætning til Kupffer cAlen (KCS), som normalt opholder sig i microvasculature af sinusoider. Hepatocytter besætte den anden side af rummet af These. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Skematisk af perfusion apparatet. A) Opsætning af apparater under skylning / vask af sinusoider i leveren. TBS er i en 1 L kolbe. B) en 125 ml kolbe, som indeholder ~ 60 ml buffer 2 med collagenase bruges til fordøjelse af leveren i et lukket kredsløb. Spildevandet linje er også ændret fra affaldet beholder til kolbe B gennem et hak skæres i gummiprop. Den ilt linje er ikke under vand ind i en buffer indeholdende collagenase (kolbe B) for at undgå skumdannelse. Stopperne på hver kolbe er notched at tillade effektiv overførsel af spildevandet linje og for at forhindre øget pres fra ilt gas. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. </sTrong&gt; hepatocyt præparater ikke er forurenede med sek. Lige store mængder af cellelysater fra renset partier af hepatocytter (bane 1) og sekunder (bane 2) var adskilt af 5% SDS-PAGE og udslettede til nitrocellulose. Monoklonalt antistof # 30, der er specifikt mod både isoformer (315 kDa og 190 kDa) af HARE/Stabilin-2 blev brugt til at undersøge lysates. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Fordeling af mærket heparin i organer. Rotter blev injiceret via de laterale halen venen med 125 I-SA-b-hep vente i 30 minutter og derefter exsanguinated. Blod blev indsamlet, så for ikke at give nogen organer kunstigt høje målinger. Tæller per minut (CPM) i hvert organ blev normaliseret i forhold til vægten af ​​orglet i gram. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figur 5"/> Figur 5. Mængden af mærket heparin i hepatocytter og sek. RPMJeg medier, der indeholder 125 I-SA-b-Hep fik lov til at cirkulere gennem en intakt lever i 20 minutter efterfulgt af collagenase fordøjelse og cellulære rensning. Lige dele hepatocyt og SEK celle protein lysates blev kvantificeret med Bradford Assay og talte med en gamma-tæller. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figur 6"/> Figur 6. Kupffer celler er adskilt fra sek ved vedhæftning på glas. Cellerne blev placeret i en syre-skyllet glas krystalliserende fad og lov til at holde sig i 15 min ved 37 ° C, 5% CO 2. Den supernatent indeholder ikke-levet celler var skvulpes forsigtigt og placeres i et centrifugeglas. Lysates fra begge levet celler på glas (bane 1) og fra ikke-tilsluttede celler (bane 2) var adskilt af 8% SDS-PAGE, udslettet, og tastede med et antistof mod CD163, der er specifik for Kupffer celler. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figur 7"/> Figur 7. Sek belagt på fibronektin coated plast 6-godt retter blev inkuberet natten over i RPMI suppleret med 0,1% BSA. Fase kontrastrige billeder blev taget på (A), 100x og (B) 200x forstørrelse.

<ol>
	<li>Elvevold, K., Smedsrod, B., Martinez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sinusoidal+endothelial+cell:+a+cell+type+of+controversial+and+confusing+identity.">The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 294, G391-G400 (2008).</li><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol. Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochem. J. 266, 313-327 (1990).</li><li>Shiratori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sinusoidal+cell+function+in+vivo.">Quantification of sinusoidal cell function in vivo.</a> Semin. Liver. Dis. 13, 39-49 (1993).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eriksson, S., Fraser, J. R., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+vitro+on+the+uptake+and+degradation+of+sodium+hyaluronate+in+rat+liver+endothelial+cells.">Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells.</a> Biochem. J. 223, 617-626 (1984).</li><li>Harris, E. N., Kyosseva, S. V., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+processing,+and+glycosaminoglycan+binding+activity+of+the+recombinant+human+315-kDa+hyaluronic+acid+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Expression, processing, and glycosaminoglycan binding activity of the recombinant human 315-kDa hyaluronic acid receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 282, 2785-2797 (2007).</li><li>Alkhouri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+the+Pediatric+NAFLD+Fibrosis+Index+and+Enhanced+Liver+Fibrosis+Test+Identifies+Children+with+Fibrosis.">A Combination of the Pediatric NAFLD Fibrosis Index and Enhanced Liver Fibrosis Test Identifies Children with Fibrosis.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. , (2010).</li><li>Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+liver+endothelial+cells:+a+cell+culture+model+for+studies+of+motility+and+angiogenesis.">Immortalized liver endothelial cells: a cell culture model for studies of motility and angiogenesis.</a> Lab. Invest. 90, 1770-1781 (2010).</li><li>Zhou, B., Weigel, J. A., Fauss, L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Identification of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 275, [pii]- (2000).</li><li>Krause, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-supported+serum-free+culture+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J. Hepatol. 32, 718-726 (2000).</li><li>Esser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+endothelial+fenestrations+in+vitro.">Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro.</a> J. Cell. Biol. 140, 947-959 (1998).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods. Cell. Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Blomhoff, R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+rat+liver+stellate+cells.">Isolation and cultivation of rat liver stellate cells.</a> Methods. Enzymol. 190, 58-71 (1990).</li><li>Harris, E. N., Baggenstoss, B. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+and+human+HARE/stabilin-2+are+clearance+receptors+for+high-+and+low-molecular-weight+heparins.">Rat and human HARE/stabilin-2 are clearance receptors for high- and low-molecular-weight heparins.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1191-G1199 (2009).</li><li>Karaa, A., Kamoun, W. S., Clemens, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+disrupts+nitric+oxide+synthase+activation+in+liver+endothelial+cells.">Oxidative stress disrupts nitric oxide synthase activation in liver endothelial cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. 39, 1320-1331 (2005).</li><li>Gustafson, S., Bjorkman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hyaluronan,+chondroitin+sulphate+and+dextran+sulphate+bind+to+a+liver+receptor+that+does+not+recognize+heparin.">Circulating hyaluronan, chondroitin sulphate and dextran sulphate bind to a liver receptor that does not recognize heparin.</a> Glycoconj. J. 14, 561-568 (1997).</li><li>Oie, C. I., Olsen, R., Smedsrod, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+the+principal+site+for+elimination+of+unfractionated+heparin+from+the+circulation.">Liver sinusoidal endothelial cells are the principal site for elimination of unfractionated heparin from the circulation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 520-528 (2008).</li><li>Harris, E. N., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE/Stabilin-2)+is+a+systemic+clearance+receptor+for+heparin.">The human hyaluronan receptor for endocytosis (HARE/Stabilin-2) is a systemic clearance receptor for heparin.</a> J. Biol. Chem. 283, 17341-17350 (2008).</li><li>Knook, D. L., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Kupffer+and+endothelial+cells+of+the+rat+liver+by+centrifugal+elutriation.">Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation.</a> Exp. Cell. Res. 99, 444-449 (1976).</li><li>Graupera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endothelial+COX-1-derived+prostanoids+modulate+the+hepatic+vascular+tone+of+cirrhotic+rat+livers.">Sinusoidal endothelial COX-1-derived prostanoids modulate the hepatic vascular tone of cirrhotic rat livers.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 763-770 (2005).</li><li>Yannariello-Brown, J., Zhou, B., Ritchie, D., Oka, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ligand+blot+assay+detects+different+hyaluronan-binding+proteins+in+rat+liver+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells.">A novel ligand blot assay detects different hyaluronan-binding proteins in rat liver hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Bedøvelse af rotte ved hængning slip-metoden, hvor isofluran damp inducerer bevidstløshed er den foretrukne metode for vores studier. En vaporizer kan også anvendes i stedet for en sprøjte med bomuld for at bevare dyret uden for mødesalen, men de kirurgiske procedurer er så hurtig, det er ikke påkrævet. Polyethylenglycol føjes til isofluran at sænke damptrykket og fordampningshastighed. For meget isofluran dampe vil medføre døden for hurtigt. Hvis dyret dør, før leveren er kanylerede og blancheret med TBS, pooling blod kan koagulere i leveren og forhindre en effektiv vask af sinusoider og fordøjelse med collagenase. Tilføjelsen af ​​heparin kan være nyttig som en antikoagulans, men er ikke anvendt i disse undersøgelser, da vi anvender mærket heparin som vores sonde. Gey er bufferet saltvandsopløsning (GBSS) er ofte erstattes af andre laboratorier til rensning af sek. Selv om det er nyttigt for SEC rensning, HEPatocytes tolererer ikke GBSS samt Buffere 1-3 og viabilities er ikke nær så høj. Ved måling af endocytose, er det god praksis at måle baggrundsniveauer i orglet og i renset hepatocytter. Denne metode er en af ​​to til effektiv rensning af sekunder efter leveren perfusion med collagenase. Den anden metode adskiller non-parenkymceller ved elutriation centrifugering 19 i stedet for Percoll gradient. Fordelene for brug af elutriation end Percoll gradienter er en anelse højere celle viabilities og tal. Ulempen er, at elutriation centrifugering kræver en specialiseret rotor, dedikeret centrifuge, og peristaltisk pumpe sammen som koster titusindvis af dollars. Denne metode kræver kun brug af en nedkølet bordplade centrifuge og peristaltisk pumpe, som er standard i mange laboratorier. Adskillelse af sekunder og KCS ved selektiv vedhæftning er en standard metode20-22. Selv om det er sandt, at Sek vil holde sig til glas og plastik, det afgørende punkt er at bruge syre-vasket rene glas med ikke mere end en 15 minutters inkubation ved 37 ° C ved 5% CO 2. KCS vil altid holde sig hurtigere end sekunder og det er tilrådeligt at forsigtigt vaske KCS med medierne for at udvinde eventuelle resterende sek, der er blevet løst tilknyttet. Pronase og andre proteaser er også udeladt fra collagenase fordøjelsen skridt i denne protokol for at øge viabilities af cellerne. Proteaser fordøje ekstracellulære receptorer og kan hæmme cellulær vedhæftning i den endelige rensning skridt. Metoden præsenteres her har en bred vifte af applikationer. Selvom vi viser det endelige resultat, hvor heparin i første omgang taget op til clearance, perfusion af leveren for at opnå primære hepatocytter, kan KC, Sek, og HSCs være nyttigt for en række undersøgelser med metaboliske veje, immunoregulation, ådselsæder aktiviteter og andre fysiologiske Studies. Den sværeste del af denne procedure er god kanylering, fordøjelsen af ​​leveren, og håndtering af leveren uden at have kateteret glide fra portalen vene.

<ul><li> Buffer 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer 2 (perfusion buffer): 67,0 mM NaCl, 6,7 mM KCl, 4,8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Buffer 3: 137 mm NaCl, 4,7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15g / L BSA i RPMI </li><li> TRIS-bufferet saltvand (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt. </li><li> Collagenase: Collagenase A (# 11088785103) fra Roche, Collagenase Type I (# LS004691) fra Worthington Biokemisk eller Collagenase I (# C0130) eller IA (# C9891) fra Sigma-Aldrich. </li></ul> Alle salte er fra Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Model / katalog # </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> 20L vandbad </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Vand er omkring 45 ° C for at kompensere for køling </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> i slangen. </td></tr><tr><td> Peristaltisk pumpe </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serie </td></tr><tr><td> Køle-Centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> Legend XTR </td><td></td></tr><tr><td> Kateter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Ekssikkator kammer </td><td> Fisher </td><td> 08595E </td><td> Brug interne plade </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mM mesh </td><td> Spectrum Labs </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 μm mesh </td><td> Spectrum Labs </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenglycol </td><td> Spectrum labs </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Leveren er det metaboliske midten af ​​pattedyr kroppen og fungerer som et filter for blodet. Den grundlæggende arkitektur leveren er illustreret i figur 1, hvor mere end 85% af leveren masse består af hepatocytter og de resterende 15% af den cellulære massen er sammensat af Kupffer celler (KCS), stellate celler (HSCs), og sinusformet endotelceller (sek). Sek danne blodkarrenes vægge i leveren og indeholder specialiserede morfologi kaldet fenestrae inden i cytoplasmaet. Facadeentreprenør af cytoplasma, er forekomsten af huller (~ 100 mM) i cellerne, så Sek fungere som en si, hvor de fleste chylomikroner, chylomicron rester og makromolekyler, men ikke cellerne, passere til hepatocytter og HSCs 1 (Fig. 1). På grund af manglen på en basalmembran, kløften mellem sekunder og hepatocytter danner rum for These. HSCs besætte denne plads og spille en fremtrædende rolle i regulering og reaktion injury, opbevaring af retinsyre og immunoregulation i leveren 2. Sek er blandt de mest endocytically aktive celler i kroppen vise en bred vifte af scavenger receptorer på deres celle overfladen 3. Disse omfatter SR-A, Stabilin-1 og Stabilin-2. Generelt er små kolloide partikler mindre end 230 nm og makromolekyler i buffer fase taget op af Sek, henviser til, at store partikler og celleaffald endocytose (fagocytose) ved KCS 4. Således er hovedparten clearance af ekstracellulære materiale såsom glycosaminoglycaner fra blod er i vid udstrækning afhængig af sundheden og endocytic funktioner sek 5,6. For eksempel er en stigning i blodets hyaluronan niveauer tyder på leversygdom spænder fra milde til mere alvorlige former 7. Med undtagelse af en enkelt rapport 8, er der ingen udødeliggjort SEK cellelinjer i eksistens. Selv denne udødeliggjort cellelinie er de-differentieretolereres i, at det ikke udtrykker scavenger receptorer, der er til stede på den primære sek (vores data ikke vist). Alle cellebiologiske undersøgelser skal udføres på den primære celler udtaget frisk fra dyret. Desværre sek dedifferentiate under standard dyrkningsbetingelser og skal bruges inden for 1 eller 2 dage efter isoleret fra dyret. Differentiering af Sek er præget af udtryk for Stabilin-2 eller hare receptor 9, CD31, og tilstedeværelsen af cytoplasmiske vindues 1. Differentiering af sekunder kan udvides ved tilføjelse af VEGF i kultur, medier eller ved dyrkning af celler i hepatocyt konditioneret medium 10,11. I denne rapport vil vi demonstrere endocytic aktivitet sekunder i den intakte orgel ved hjælp af radio-mærket heparin for hyaluronan for SEC-specifikke Stabilin-2 receptoren. Vi vil derefter rense hepatocytter og sek fra den perfunderet leveren til at måle endocytose.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Undersøgelsen af ​​lever sinusformet endotelceller (sek) skal udføres med primære celler udtaget fra dyret, da der ikke cellelinjer eksisterer. Denne metode bygger på leveren fordøjelsen og differential centrifugering for SEC rensning for efterfølgende dyrkning og eksperimenter.

In vivo Lever Endocytose Efterfulgt af rensning af leverceller af lever perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering af rotte portal fibroblaster ved<em&gt; In situ</em&gt; Lever Perfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokol for Lentiviral transduktion og nedstrøms analyse af Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokol til Isolering af primære humane hepatocytter og Tilsvarende Major populationer af ikke-parenchymale leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fækal Glukokortikoid Analyse: Non-invasive Adrenal Overvågning i dyr fra hestefamilien

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...