Name: in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion
Uploaded: 2011-11-10T12:00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

Vi ønsker å takke Dr. Paul Weigel ved Univ.. of Oklahoma for bruk av monoklonale antistoffer 30 for påvisning av HARE/Stabilin-2 reseptoren og Janet Weigel for henne teknisk assistanse. Denne forskningen er finansiert av University of Nebraska forskningsmidler.

1. Eksisjon av leveren (adoptert fra PO Seglen 12 og R. Blomhoff 13 med modifikasjoner 14,15) <ol><li> Tilsett 10 ml 30% isofluran i polyetylenglykol til en petriskål i et lukket 5,5 L kammer. Det er optimalt å vente 10-15 min etter tilsetning av isofluran for å skape en stabilisert atmosfære i kammeret. </li><li> Plasser en rotte i forseglet kammer og la den bli bedøvet. Full effekt av anestesi er tydelig når dyret blir limp, svarer og utstillinger dyp pusting. </li><li> Plasser 2 mL av isofluran i polyetylenglykol i noen bomull baller i bunnen av en 30 ml sprøyte tube. </li><li> Plasser rotte på ryggen på en bleie-dekket skuffen og legg sprøyten tube over snuten. </li><li> Umiddelbart bekrefte dyp anestesi ved tisse buken med 70% etanol. Ikke la dyret dø av isofluran overdose. </li><li> Bruk bandasje saks og pinsett, utsette hele abdominal hulrom. </li><li> Finn vena porta, og bruker tang, tegne to tråder av kirurgisk silke eller polyester tråd (ligatur) under vena porta rett over mesenteric grenen. </li><li> Trekk tang og knyt en løs halvstikk-knute. </li><li> Bruk pinsett under vena porta og forsiktig dra tilbake for å rette ut venen, cannulate venen med en Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences) eller tilsvarende kateter. Kateteret bør gå flere mm utenfor løkken dannet av tråden. </li><li> Trekk og fjerne nålen ved å slippe den fjærbelastede trigger på kateteret. Blod bør starte siver opp i kateteret indikerer riktig ligatur plassering. </li><li> Stram ned halvstikk-knute og fest den med en annen halvstikk-knute. </li><li> Sever enten mindreverdige vena cava eller synkende hovedpulsåren (aorta abdominalis) for å la blodet renne fra sirkulasjonssystemet. </li><li> Begynn spyling leveren med oksygenriktTBS ved 37 ° C for å fjerne blodet (blanchering) ved en flow rate på 20 ml / min. Leveren skal slå fra rødlilla til en leirjord farge. </li><li> Mens leveren er flushing, avgifter leveren ved å kutte vekk mage-tarmkanalen og bindevev. Det er viktig å ikke lage rift i leveren eller punktere Glisson i kapselen. </li><li> Plasser lever på en plastikk nett over en trakt som gjør at buffere skal samles inn og resirkuleres. Buffere på dette punktet bør ikke resirkuleres, men strømme inn i avfallet begerglasset. Flushing bør ikke vare mer enn 10 min. (Fig. 2A). Klargjør endocytose løsningen som kreves i trinn 2.1. </li></ol> 2. Internalisering av 125 I-SA-b-Hep (eller andre egnede merket ligand) <ol><li> Til 50 ml RPMI media i et lite begerglass, legge til en endelig konsentrasjon 0,05% BSA og 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep eller andre passende merket ligand for endocytose. </li><li> Fest dette beger til apparatuer å tillate for oksygenering. </li><li> Slå av pumpen, bytte innløpsslangen, og deretter slå på pumpen ved 20 ml / min. </li><li> Ettersom merket RPMI nærmer leveren, skru av pumpen og la overflødig væske i trakten og slangen avløp. </li><li> Plasser renne slangen inn i mediene begerglasset å tillate resirkulering av merket media og deretter starte pumpen. </li><li> La væsker til resirkulering gjennom leveren for ikke mer enn 1 time. </li><li> I løpet av denne internalisering trinnet, må du passe på at temperaturen i leveren er stabil ved å dekke den og forberede collagenase for fordøyelsen. </li></ol> 3. Fordøyelse av leveren ved collagenase fordøyelsen <ol><li> Fersk oppløst og filtrert (0,45 mikrometer) collagenase (100 mg / kg rotte vekt) bør legges til buffer 2 i et samlet volum ikke skal overstige 60 ml ved 37 ° C. Volumet er avhengig av lengde / innvendig volum av slangen og bør justeres tilsvarende. </li><li> Stopp pumpen og utveksleinnløpsslangen fra media begeret til TBS. </li><li> Skyll leveren i 2 min ved 50 ml / min som gjør det mulig for løsning av desmosomal celle veikryssene som er kalsium avhengige. </li><li> Mens leveren er rødme, utveksling media begerglasset med begerglasset som inneholder collagenase på apparatet. </li><li> Umiddelbart etter spyling, begynner fordøyelsen med collagenase i en sirkulasjons løkke ved en vannmengde på 20 ml / min for opp til 15 min. Siden collagenase partier varierer med partinummer, variasjoner i mengde og tidspunkt for fordøyelsen må være optimalisert for hvert nytt parti med collagenase. Collagenase er også kalsium avhengig. Slå av pumpen og slå buffer og gass linjer fra Flask A til Flask B. Transfer avløpsvannet linje fra avfallsbeholderen til Flask B (Fig. 2B). </li><li> Stopp pumpen, fjerne kateteret og overføre leveren til en tallerken som inneholder 20-30 mL buffer 1. </li><li> Skrell tilbake Glisson sin kapsel av leveren og rist cellener ute i væsken. </li><li> Som væsken blir ugjennomsiktig med kroppsceller, overføre cellene gjennom en 100 mikrometer mesh etterfulgt av filtrering gjennom en 30 mikrometer mesh og deretter i en 50 ml konisk på is. </li><li> Legg til flere Buffer 1 til leveren og fortsette risting celler fra leveren matrise, overføre væsken til mesh filter og koniske. </li><li> Gjenta trinn 3.7 til 3.9 til det ikke flere celler kan forskyves med rimelig risting av leveren. </li></ol> Fire. Hepatocytter og SEC rensing <ol><li> Sentrifuger 50 mL conicals inneholder celler ved 150 xg i 3 min. å pellet på hepatocytter. </li><li> Overfør væskefraksjon inneholder ikke-parenkymatøs celler til frisk 50 mL conicals på is. </li><li> Vask hepatocytter være resuspending pelleten i buffer 3 og gjenta trinn 4.1 og 4.2 tre ganger. </li><li> På slutten av vasker, pellets er ≥ 97% ren hepatocytter. For å få Sekunder, sentrifuger alle rørene containing sammenslåtte supernatanten (som inneholder HSCs, sek, og KCS og noen små hepatocytter) på 200 xg i 10 min. ved 4 ° C. </li><li> Aspirer buffer og resuspender alle pellets i 5 ml RPMI / BSA ved 4 ° C. </li><li> Pool cellene sammen i 2 rør og legg RPMI / BSA opp til et volum på 35 ml. </li><li> Sentrifuger conicals på 100 xg i 3 min. </li><li> Samle topp 25 ml væske og overføring til en ren 50 ml konisk. </li><li> Resuspender pellet i de resterende 10 ml media og legge tilbake 25 ml kaldt RPMI / BSA og sentrifuger ved 100 xg i 3 min. </li><li> Gjenta trinn 3.8 og 3.9 en gang, kast cellepelleten og nedre 10 mL media. </li><li> Sentrifuger supernatents til pelleten sek, KCS, og HSCs på 200 xg i 10 min. ved 4 ° C. </li><li> Forbered tre 50 ml rør som inneholder 20 ml 25% Percoll i PBS på is. Underlag med 15 ml 50% Percoll i hvert rør. </li><li> Resuspender cellen pellets i et totalvolum på 30 ml RPMI / BSA. </li><li> Nøye overlay EACh gradient med 10 mL av celler og sentrifuger ved 900 xg i 20 min ved 4 ° C. </li><li> Sekunder og KCS har svært nære spenstig tettheter og er på 25/50% grensesnitt. HSCs er vanligvis på 25% / media interface pga større oppdrift som lipid lagring celler. Eventuelle gjenstående hepatocytter og blod celler har lavere buoyancies og pelleterte. Aspirer ovenfra og ned nær 25/50% grensesnitt og kast dette materialet. </li><li> Samle cellene i 25/50% grensesnitt og overføring til en frisk konisk med kalde RPMI. Den endelige volum bør være ~ 40 mL å fortynne ut Percoll. </li><li> Sentrifuger koniske ved 350 xg i 10 min ved 4 ° C til pellet cellene. </li><li> Suspender cellene i ~ 10 ml forvarmet RPMI inneholder 100 U / mL Penicillin/100 g / mL Streptomycin og plassere celler i en syre-vasket glass petriskål eller krystalliserende parabolen. </li><li> Inkuber cellene i 15 min. ved 37 ° C i en vev kulturinkubatoren. </li><li> Rock eller virvel platen littog deretter samle Sekunder i supernatanten. Den KCS avbestiller i glasset mye raskere enn sek. Alternativt kan Sekunder skilles fra KCS ved immunopurification hjelp av anti-CD31 eller anti-Stabilin2/HARE antistoff konjugert til magnetiske kuler. </li><li> Levedyktighet og celle tall kan vurderes ved trypan blå eksklusjon med en hemacytometer eller med hjelp av en automatisk celleteller. </li><li> Kultur i sek på fibronektin-belagt plast retter ved 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA med 40 ng / ml VEGF, 100 U / ml Penicillin, 100 mikrogram / ​​mL Streptomycin eller med hepatocytter betinget media. </li><li> Hepatocytter, KCS, og Sekunder kan vurdere for internalisering av merket materiale ved bruk av gamma counter og normalisering til total cellulær protein eller ved mikroskopi (hvis fluorescensmerkede) ved hjelp av disse dyrking metoder. </li></ol> 5. Representative resultater: Hepatocytter rensing er ≥ 97% og SEC rensing er typicalliert ≥ 95% ved hjelp av denne metoden. Eksisjon av bukhulen, cannulation av portvenen, og blanchering av leveren alle bør skje innen et minutt for best resultat. HARE/Stabilin-2 er en spesifikk reseptor på leveren Sekunder og er ikke uttrykt i andre lever celletyper. I dette utvalget var celle lysates både hepatocytter og Sekunder atskilt med 5% SDS-PAGE og probed med et monoklonalt antistoff mot begge isoformer av Stabilin-2 (Fig. 3). Ufraksjonert heparin injiseres i blodet er ryddet av leveren 16. Clearance er hovedsakelig utført av leveren Sekunder i motsetning til hepatocytter og KCS 17. Den Stabilin-2/HARE reseptoren er den viktigste klarering reseptoren som binder og internalizes heparin i sek 18 år. I vårt eksempel her, merket vi heparin med biotin koden på karboksylat gruppen av GlcNAc / NS. Den biotin ble konjugert med jodholdige streptavidin for påvisning av internalisert heparin Proteoglycan. Injeksjon av merket heparin etterfulgt av exsanguination 30 minutter etter injeksjon tillater oss å overvåke hvilke organer internalisere denne formen for heparin. I denne korte tidsintervall, er leveren det primære klaring organ (fig 4). For tydeligere å forstå hvilken celletype er ansvarlig for rydding, la vi 125 I-SA-b-Hep til RPMI media supplert med 0,05% BSA og tillot den å sirkulere gjennom leveren i 20 min. Etter collagenase fordøyelsen og cellulære rensing, er det store flertallet av merket heparin internalisert ved Sekunder i motsetning til hepatocytter (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Basic lever arkitektur. Sekunder danner veggene i sinusoids og er normalt fenestrated (små klynger av sirkler). Stellate celler (HSCs) er funnet i løpet av Disse, i motsetning til Kupffer calen (KCS) som normalt er tilstede i microvasculature av sinusoids. Hepatocytter okkupere den andre siden av Space of Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Skjematisk av perfusjon apparatet. A) Sett opp apparater under spyling / vask av sinusoids av leveren. TBS er i en 1 L flaske. B) En 125 mL kolbe inneholder ~ 60 mL buffer 2 med collagenase brukes for fordøyelsen av leveren i en lukket krets. Avløpsvannet linjen er også endret fra avfallsbeholderen til kolbe B gjennom et hakk kutt i gummiproppen. Oksygenet linjen er ikke nedsenket inn i buffer som inneholder collagenase (kolbe B) for å unngå skumdannelse. Proppene på hver kolbe er notched å tillate effektiv overføring av avløpsvann linje og for å hindre økt press fra oksygengass. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. </strong&gt; hepatocytter preparater er ikke forurenset med sek. Like mengder celle lysates fra renset grupper av hepatocytter (kjørefelt 1) og sek (kjørefelt 2) ble separert med 5% SDS-PAGE og utslettet til nitrocellulose. Monoklonalt antistoff # 30 som er spesifikk mot både isoformene (315 kDa og 190 kDa) av HARE/Stabilin-2 ble brukt til å sondere lysates. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Fordeling av merket heparin i organer. Rotter ble injisert via lateral halen vein med 125 I-SA-b-hep vente i 30 minutter og deretter exsanguinated. Blod ble samlet slik at ikke å gi noen organer kunstig høye målinger. Tellinger per minutt (CPM) for hvert organ var normalisert mot vekten av orgelet i gram. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figur 5"/> Figur 5. Mengde av merket heparin i hepatocytter og sek. RPMJeg media inneholder 125 I-SA-b-Hep fikk lov til å sirkulere gjennom et intakt lever for 20 min etterfulgt av collagenase fordøyelsen og cellulære rensing. Like mengder av hepatocytter og SEC cell protein lysates ble kvantifisert med Bradford Assay og regnes som en gamma teller. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figur 6"/> Figur 6. Kupffer celler er atskilt fra Sekunder ved feste på glass. Celler ble plassert i en syre-vasket glass krystalliserende rett og lov til å følge i 15 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2. Den supernatent inneholder ikke-levd cellene var roteres forsiktig og plasseres i en sentrifuge tube. Lysates fra begge levd celler på glass (kjørefelt 1) og fra ikke-levd celler (kjørefelt 2) ble separert med 8% SDS-PAGE, strøket, og analysert med et antistoff mot CD163 som er spesifikk for Kupffer celler. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figur 7"/> Figur 7.. Sekunder belagt på fibronektin belagt plast 6-vel retter ble inkubert over natten i RPMI supplert med 0,1% BSA. Fasekontrast bildene ble tatt på (A) 100x og (B) 200x forstørrelse.

<ol>
	<li>Elvevold, K., Smedsrod, B., Martinez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sinusoidal+endothelial+cell:+a+cell+type+of+controversial+and+confusing+identity.">The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 294, G391-G400 (2008).</li><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol. Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochem. J. 266, 313-327 (1990).</li><li>Shiratori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sinusoidal+cell+function+in+vivo.">Quantification of sinusoidal cell function in vivo.</a> Semin. Liver. Dis. 13, 39-49 (1993).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eriksson, S., Fraser, J. R., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+vitro+on+the+uptake+and+degradation+of+sodium+hyaluronate+in+rat+liver+endothelial+cells.">Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells.</a> Biochem. J. 223, 617-626 (1984).</li><li>Harris, E. N., Kyosseva, S. V., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+processing,+and+glycosaminoglycan+binding+activity+of+the+recombinant+human+315-kDa+hyaluronic+acid+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Expression, processing, and glycosaminoglycan binding activity of the recombinant human 315-kDa hyaluronic acid receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 282, 2785-2797 (2007).</li><li>Alkhouri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+the+Pediatric+NAFLD+Fibrosis+Index+and+Enhanced+Liver+Fibrosis+Test+Identifies+Children+with+Fibrosis.">A Combination of the Pediatric NAFLD Fibrosis Index and Enhanced Liver Fibrosis Test Identifies Children with Fibrosis.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. , (2010).</li><li>Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+liver+endothelial+cells:+a+cell+culture+model+for+studies+of+motility+and+angiogenesis.">Immortalized liver endothelial cells: a cell culture model for studies of motility and angiogenesis.</a> Lab. Invest. 90, 1770-1781 (2010).</li><li>Zhou, B., Weigel, J. A., Fauss, L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Identification of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 275, [pii]- (2000).</li><li>Krause, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-supported+serum-free+culture+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J. Hepatol. 32, 718-726 (2000).</li><li>Esser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+endothelial+fenestrations+in+vitro.">Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro.</a> J. Cell. Biol. 140, 947-959 (1998).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods. Cell. Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Blomhoff, R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+rat+liver+stellate+cells.">Isolation and cultivation of rat liver stellate cells.</a> Methods. Enzymol. 190, 58-71 (1990).</li><li>Harris, E. N., Baggenstoss, B. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+and+human+HARE/stabilin-2+are+clearance+receptors+for+high-+and+low-molecular-weight+heparins.">Rat and human HARE/stabilin-2 are clearance receptors for high- and low-molecular-weight heparins.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1191-G1199 (2009).</li><li>Karaa, A., Kamoun, W. S., Clemens, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+disrupts+nitric+oxide+synthase+activation+in+liver+endothelial+cells.">Oxidative stress disrupts nitric oxide synthase activation in liver endothelial cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. 39, 1320-1331 (2005).</li><li>Gustafson, S., Bjorkman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hyaluronan,+chondroitin+sulphate+and+dextran+sulphate+bind+to+a+liver+receptor+that+does+not+recognize+heparin.">Circulating hyaluronan, chondroitin sulphate and dextran sulphate bind to a liver receptor that does not recognize heparin.</a> Glycoconj. J. 14, 561-568 (1997).</li><li>Oie, C. I., Olsen, R., Smedsrod, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+the+principal+site+for+elimination+of+unfractionated+heparin+from+the+circulation.">Liver sinusoidal endothelial cells are the principal site for elimination of unfractionated heparin from the circulation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 520-528 (2008).</li><li>Harris, E. N., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE/Stabilin-2)+is+a+systemic+clearance+receptor+for+heparin.">The human hyaluronan receptor for endocytosis (HARE/Stabilin-2) is a systemic clearance receptor for heparin.</a> J. Biol. Chem. 283, 17341-17350 (2008).</li><li>Knook, D. L., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Kupffer+and+endothelial+cells+of+the+rat+liver+by+centrifugal+elutriation.">Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation.</a> Exp. Cell. Res. 99, 444-449 (1976).</li><li>Graupera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endothelial+COX-1-derived+prostanoids+modulate+the+hepatic+vascular+tone+of+cirrhotic+rat+livers.">Sinusoidal endothelial COX-1-derived prostanoids modulate the hepatic vascular tone of cirrhotic rat livers.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 763-770 (2005).</li><li>Yannariello-Brown, J., Zhou, B., Ritchie, D., Oka, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ligand+blot+assay+detects+different+hyaluronan-binding+proteins+in+rat+liver+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells.">A novel ligand blot assay detects different hyaluronan-binding proteins in rat liver hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Anestesi av rotte ved henging slipp-metoden hvor isofluran damp medføre bevisstløshet er den foretrukne metoden for våre studier. En vaporizer kan også brukes i stedet for en sprøyte med bomull for å opprettholde dyret utenfor kammeret, men den kirurgiske prosedyrer er så rask, det er ikke nødvendig. Polyetylenglykol legges til isofluran for å redusere damptrykk og fordamping rate. For mye isofluran vanndamp vil forårsake døden for raskt. Hvis dyret dør før leveren er cannulated og forvellet med TBS, pooling blodet kan koagulere i leveren og hindre effektiv vask av sinusoids og fordøyelse med collagenase. Tillegg av heparin kan være nyttig som en antikoagulant men er ikke brukt i disse studiene ettersom vi bruker merket heparin som probe vår. Gey er buffered saltløsning (GBS) er ofte erstattet av andre laboratorier for rensing av sekunder. Mens det er nyttig for SEC rensing, hepatocytes tolererer ikke GBS samt Buffers 1-3 og viabilities er ikke på langt nær så høy. Ved måling endocytose, er det god praksis å måle bakgrunnsnivå i orgelet og i renset hepatocytter. Denne metoden er en av to for effektiv rensing av Sekunder etter leveren perfusjon med collagenase. Den andre metoden skiller non-parenkymatøs celler ved elutriation sentrifugering 19 istedenfor Percoll gradient. Fordelene for bruk elutriation enn Percoll graderinger blir litt høyere celle viabilities og tall. Ulempen er at elutriation sentrifugering krever en spesialisert rotor, dedikert sentrifuge, og peristaltiske pumper sammen som koster titusenvis av dollar. Denne metoden krever kun bruk av en nedkjølt bordplate sentrifuge og peristaltiske pumper som er standard i mange laboratorier. Separasjon av sekunder og KCS ved selektiv adhesjon er en standard metode20-22. Mens det er sant at Sekunder vil forholde seg til glass og plast, er nøkkelen for å bruke syre-vasket rent glass med ikke mer enn en 15 minutters inkubasjon ved 37 ° C ved 5% CO 2. KCS vil alltid forholde seg raskere enn sekunder og det er tilrådelig å forsiktig vaske KCS med media å trekke ut eventuelle gjenværende Sekunder som har blitt løst vedlagt. Pronase og andre proteaser er også utelatt fra collagenase fordøyelsen trinnene i denne protokollen for å øke viabilities av cellene. Proteaser fordøye ekstracellulær reseptorer og kan hemme cellulær vedheft i den endelige renselse trinn. Metoden som presenteres her har et bredt utvalg av applikasjoner. Selv om vi viser sluttresultatet der heparin er i utgangspunktet tas opp for klarering, perfusjon av leveren for å innhente primære hepatocytter, kan KC, sek, og HSCs være nyttig for en rekke studier med metabolske veier, immunoregulation, scavenger aktiviteter, og andre fysiologiske Studies. Den vanskeligste delen av denne prosedyren er god cannulation, fordøyelse av leveren, og håndtering av leveren uten å ha kateteret slip fra portalen blodåre.

<ul><li> Buffer 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer 2 (perfusjon buffer): 67,0 mM NaCl, 6,7 mM KCl, 4.8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Buffer 3: 137 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0.7 mM MgSO 4, 1.2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15g / L BSA i RPMI </li><li> Tris-bufret saltvann (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt. </li><li> Collagenase: collagenase A (# 11088785103) fra Roche, collagenase Type I (# LS004691) fra Worthington Biokjemiske eller collagenase I (# C0130) eller IA (# C9891) fra Sigma-Aldrich. </li></ul> Alle salter er fra Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Model / katalog # </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> 20L vannbad </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Vann er ca 45 ° C for å kompensere for kjøling </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> innenfor slangen. </td></tr><tr><td> Peristaltiske Pump </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serien </td></tr><tr><td> Kjøle Centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> Forklaring XTR </td><td></td></tr><tr><td> Kateter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Dessicator kammer </td><td> Fisher </td><td> 08595E </td><td> Bruk indre plate </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikrometer mesh </td><td> Spectrum labs </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mikrometer mesh </td><td> Spectrum labs </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polyetylenglykol </td><td> Spectrum laber </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Leveren er den metabolske midten av pattedyr kroppen og fungerer som et filter for blodet. Den grunnleggende arkitekturen av leveren er illustrert i figur 1 der mer enn 85% av leveren massen består av hepatocytter og de resterende 15% av cellulære massen består av Kupffer celler (KCS), stellate celler (HSCs), og sinusformet endotelceller (sek). Sekunder danne blod fartøy vegger i leveren og inneholder spesialiserte morfologi kalt fenestrae innenfor i cytoplasma. Fenestrasjon av cytoplasma er utseendet av hull (~ 100 mikrometer) i cellene slik at Sekunder fungere som en sil hvor de fleste chylomikroner, kylomikron rester og makromolekyler, men ikke celler, går gjennom til hepatocytter og HSCs 1 (Fig. 1). På grunn av mangel på en basalmembran, gapet mellom Sekunder og hepatocytter danner Space of Disse. HSCs okkupere denne plassen og spiller en fremtredende rolle i regulering og svar på injury, lagring av retinsyre og immunoregulation av leveren 2. Sekunder er blant de mest endocytically aktive celler i kroppen som viser en rekke scavenger reseptorer på celleoverflaten 3. Disse inkluderer SR-A, Stabilin-1 og Stabilin-2. Vanligvis er små kolloidale partikler mindre enn 230 nm og makromolekyler i buffer fase tatt opp av sek, mens store partikler og cellulære rusk er endocytosed (phagocytosed) ved KCS fire. Dermed er mesteparten clearance av ekstracellulært materiale som glycosaminoglycans fra blodet stor grad avhengig av helse og endocytic funksjoner sek 5,6. For eksempel er en økning i blodet hyaluronan nivåer tegn på leversykdom som spenner fra milde til mer alvorlige former 7. Med unntak av en rapport 8, er det ingen udødeliggjort SEC cellelinjer i tilværelsen. Selv dette udødeliggjort cellelinje er de-differensiertrerte i at det ikke uttrykker scavenger reseptorer som finnes på primære sek (våre data, ikke vist). Alle cellebiologiske studier må utføres på primære celler hentet ferske fra dyret. Dessverre sek dedifferentiate under standard kultur forhold og må brukes innen 1 eller 2 dager etter isolasjon fra dyret. Differensiering av sekunder er preget av uttrykket av Stabilin-2 eller HARE reseptor 9, CD31, og tilstedeværelsen av cytoplasmatiske fenestrasjon 1. Differensiering av sekunder kan utvides ved tilsetning av VEGF i kultur media eller ved dyrkning celler i hepatocytter kondisjonert medium 10,11. I denne rapporten vil vi demonstrere endocytic aktivitet Sekunder i intakt organ med radio-merket heparin for hyaluronan for SEC-spesifikke Stabilin-2 reseptoren. Vi vil deretter rense hepatocytter og Sekunder fra perfused leveren til å måle endocytose.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Studiet av leveren sinusformet endotelceller (sek) må utføres med primære celler hentet fra dyret som noen cellelinjer eksisterer. Denne metoden er avhengig av leveren fordøyelsen og differensial sentrifugering for SEC rensing for senere dyrking og eksperimentering.

In vivo Lever endocytose Etterfulgt av Rensing av leverceller av leveren Perfusjons

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering av Rat Portal Fibroblaster av<em&gt; In situ</em&gt; Liver Perfusjons

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humane hepatocytter av en to-trinns Collage Perfusjons Prosedyre

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll for isolering av Primære humane hepatocytter og tilsvarende store Bestander av ikke-parenkymatøs leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...