Name: drosophila pupal abdomen immunohistochemistry
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Science Foundation.

1. Dag 1 Voordat u begint: Een gezonde bevolking van vliegen moet worden gehandhaafd met behulp van standaard protocollen kweken: verwijder volwassenen uit flessen of flacons na 3-4 dagen van ei-lay en laat ontwikkeling tot bij een constante temperatuur te gaan tot zwerven 3 e instar larven te starten verpopping. Het larvale / popstadium overgang wordt gekenmerkt door de vorming van de prepupae (als 0 uur na puparium vorming-APF). Immobiele poppen onderscheiden zich van oudere poppen door hun witte kleur en van larven die nog niet verpopping begonnen door hun langwerpige, afgeronde vorm en uitpuilen van de voorste siphonen. Je hebt nodig: <ul><li> Een kwast voor het verzamelen van poppen </li><li> Een vochtige kamer voor het kweken van poppen: een petrischaal bekleed met papieren handdoek nat en bedekt met filtreerpapier gemarkeerd voor de verschillende tijdstippen van inzameling, genotype of het geslacht van de poppen </li><li> 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen poppen </li></ul> Verzamelen, kweken en staging poppen <ol><li> Met behulp van een vochtig penseel verwijder voorzichtig 0hr APF poppen van cultuur flessen / flacons en plaats ze in het deksel van de vochtige kamer. </li><li> Met behulp van de penseel en 1X PBS voorzichtig wassen de poppen aan vuil te verwijderen uit de pop geval </li><li> Indien nodig sorteert de poppen naar geslacht. De gonaden primordia van de poppen gebruikt kan worden om de seksen te sorteren. De mannelijke gonaden primordia zijn een laterale paar doorzichtige schijven eenvoudig gezien door het popstadium opperhuid ongeveer 2 / 3 over de lengte van het lichaam 5. De vrouwelijke gonaden primordia zijn kleiner en niet zo gemakkelijk te herkennen. </li><li> Plaats de poppen in de juiste label positie in de vochtige kamer en ga terug naar constante temperatuur. Cultuur aan de juiste ontwikkeling tijdstip. </li></ol> 2. Dag 2: Dissection, fixatie en primaire antilichaam incubatie Voordat u begint: Je hebt nodig: <ul><li> Dissection stereomicroscoop </li><li> Chirurgische tang </li><li> Chirurgische scalpel met nummer 11 bladen </li><li> Twee van negen goed glas depressie schalen (Corning product # 7220-85) <ul><li> Vul putten van een schotel met 1X PBS: Dit is de spoeling gerecht voor het reinigen ontleed poppen </li><li> Vul de putten van de tweede schotel met fixatie buffer </li></ul></li><li> Vochtige kamer voor antilichaam incubatie. We maken gebruik van plastic afsluitbaar sandwich boxen bekleed met nat keukenpapier. </li><li> Fixatie buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0,2% deoxycholinezuur (voor permeabilisatie) </li><li> Dissection platform: Clear microscoopglaasje met een stukje dubbelzijdig plakband gehandeld op grond van een kant </li><li> 1X PBS </li><li> P100 of P200 pipet </li></ul> Ontleding <ol><li> Met behulp van een tang voorzichtig verwijderen poppen een voor een tijd en plaats ze op de dissectie platform met de voorste einde van de poppen waarmee de breedste breedte van de tape. Als poppen zijn te natte, eerst dep ze droog met een papieren handdoek. </li><li> Voordat de poppen volledig gehandeld op grond van de tape, gebruik dan een penseel om ze positie. </li><li> Laat de poppen aan de lucht drogen en zich te houden aan de tape (5-10 minuten) </li><li> Met de chirurgische scalpel bilateraal ontleden elk poppen. Dit kan het beste bereikt met een enkele snelle snede van de voorste naar de achterste einde van de poppen. Als dit goed wordt gedaan, zal de cut halveren zowel de voorste en achterste siphonen paren. Ontleden niet meer dan 10 poppen in een tijd als wassen en schoonmaken van de monsters snel is nodig om te voorkomen proteolytische schade aan het weefsel. </li><li> Met behulp van een penseel, overdracht van een kleine hoeveelheid 1X PBS aan elk ontleed poppen om hen los te maken van de tape. </li></ol> Reiniging, fixatie en primaire antilichaam incubatie <ol start="6"><li> Met een paar chirurgische tang te vatten een individuele pop half naar voren en onmiddellijk onder te dompelen in een put van de spoelen schotel. De dissectie platform moet worden vervangen door de spoelen schotel op de microscoop podium. De poppen geval moet worden overgelaten aan het monster tot de verwerking is voltooid en monsters zijn klaar voor montage. </li><li> Hoewel nog steeds grijpen de pop half gebruik maken van een pipet om zachtjes weg te wassen de interne weefsel van de buik. Te veel druk tijdens het wassen kan leiden tot verlies van epitheliale cellen. </li><li> Onmiddellijk overdracht van de schone pop half tot fixatie buffer op kamertemperatuur en evenzo proces de resterende pop helften. Met de praktijk, dissectie en het wassen van 20 pop helften moeten nemen minder dan 5 minuten. </li><li> Laat poppen in fixatie buffer incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 (een) uur. </li><li> Spoel vaste poppen 3x vijf minuten in 1X PBS </li><li> Monsters kunnen direct worden verwerkt voor immunohistochemie of kunnen worden opgeslagen in 100% ethanol bij -20 ° C voor maximaal 3 maanden zonder verlies van cellen of epitoop reactiviteit. </li><li> Voor het opslaan van monsters, evenwicht monsters door een verdunningreeks van PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in elke verdunning voorafgaand aan de overdracht tot 100% EtOH. </li><li> De monsters moeten opnieuw in evenwicht worden in PBS door middel van de reverse-serie voor de verwerking voor immunohistochemie. </li><li> Block monsters in 1x PBS (aangevuld met 2% bovine serum albumine) voor 1 (een) uur voor de toevoeging van primaire antilichaam. </li><li> Incubeer met primaire antilichaam verdund tot de juiste concentratie in 1X PBS gedurende de nacht bij 4 ° C zonder schommelen. </li></ol> 3. Dag 3: tweede antilichaam incubatie, montage en imaging Voordat u begint: Je hebt nodig: <ul><li> Twee chirurgische pincet </li><li> Montage media (glycerol, Vectashield [Vector Labs], of Slowfade Gold [Invitrogen]) </li><li> Depressie goed objectglaasjes (0,8 mm) </li><li> Dekglaasjes (24 x 40 mm) </li></ul> Secundair antilichaam incubatie en montage: <ol><li> Was de monsters 3x 10 minuten met elk 1x PBS </li><li> Block monsters in 1x PBS (aangevuld met 2% bovine serum albumine) voor 1 (een) uur voor de toevoeging van secundaire antilichaam. </li><li> Incubeer met secundair antilichaam verdund tot de juiste concentratie in 1X PBS bij kamertemperatuur in het donker zonder schokken voor 3 (drie) uur. </li><li> Was de monsters 3x 10 minuten met elk 1x PBS </li><li> In voorkomend geval, tegenkleuring poppen (Voorbeeld we kernen vlek met DAPI [4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole] verdund in PBS gedurende 10 minuten). </li><li> Equilibreren monsters (minimaal 30 minuten) in geschikte media voor de montage. </li><li> Bereid een sample dia. De morfologie van de poppen voorkomt vlakke montage. Monsters zijn gemonteerd in de put van een depressie slide (drop dia) voor de beeldvorming. Plaats 75-100ul van montage media in de depressie goed. Meerdere monsters kunnen worden gemonteerd op een enkele dia. </li><li> De pop geval moet worden verwijderd van de monsters voor de montage. Pak een individueel pop geval naar voren dat zeker niet aan de interne popstadium membraan begrijpen. </li><li> Met een tweede tang voorzichtig te begrijpen van de interne popstadium membraan door het hoofd en verwijder deze uit het popstadium geval. </li><li> Onmiddellijk het monster goed over te dragen aan de depressie en verder te verwerken aanvullende monsters. </li><li> Met behulp van een sonde of een pincet positie van de monsters gelijkmatig in de depressie goed aan bij de laterale oppervlak naar boven. Af en toe luchtbellen kunnen verwijderd worden met een sonde. </li><li> Laat het dekglaasje op de monsters die zorgen dat er geen luchtbellen te introduceren </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Monsters bereid met behulp van dit protocol behouden de bruto morfologie van de volwassen buik. Afbeelding stacks kunnen worden geprojecteerd op een twee-dimensionaal beeld of 3-D rendering kunnen worden toegepast op buik topologie te onderzoeken genereren. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Segmentatie genproducten in Drosophila poppen Wingless eiwit-en Engrailed expressie (En-GAL4: UAS-GFP). Werden gevisualiseerd op 26 uur na puparium vorming (APF) met muis anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) en anti-GFP. 10x vergroting, voorste is links en dorsale om is. Nucleii werden tegengekleurd met DAPI. Stapels van ongeveer 50 beelden (ΔZ tussen plakken is 2.5μm) werden geprojecteerd.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De technieken die in deze video kan worden gebruikt om Drosophila poppen te bereiden uit een verscheidenheid van ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Poppen worden verwerkt in de periode van 24 uur tot 32 uur APF APF zijn het meest gevoelig voor cel verlies van het epitheel. Het gebruik van reinigingsmiddelen (zoals Triton X-100 en Tween-20) tijdens lange incubatie stappen verhoogt de kans op cel verlies en wordt daarom niet aanbevolen. In plaats daarvan wordt deoxycholinezuur gebruikt als reinigingsmiddel tijdens de eerste fixatie stap. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in 1X PBS zonder afwasmiddel. Bovendien, rockende monsters gedurende langere incubatie stappen verhoogt celverlies en moet worden vermeden. Monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van confocale microscopie technieken. Echter, Drosophila poppen verwerkt zoals beschreven kan ook worden afgebeeld met behulp van een gestructureerd verlichting microscopie-systeem waardoor de beeldkwaliteit die vergelijkbaar zijn met confocale technieken.

<ul><li> Dissection stereomicroscoop </li><li> Chirurgische tang </li><li> Chirurgische scalpel met nummer 11 bladen </li><li> Nine-goed glas depressie schalen (Corning product # 7220-85) </li><li> Vochtige kamer voor het kweken van poppen </li><li> 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </li><li> # 11 chirurgische scalpel </li><li> dubbelzijdige tape </li><li> Fixatie buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0,2% deoxycholinezuur (voor permeabilisatie) </li><li> P100 of P200 pipet </li><li> Depressie goed objectglaasjes (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

De Drosophila popstadium buik is een gevestigde modelsysteem voor de studie van epitheliale morfogenese en de ontwikkeling van seksueel dimorfe morfologieën 1-3. Tijdens het popstadium, die ongeveer 96 uur overspanningen (bij 25 ° C), prolifererende populaties van imaginaire cellen vervangen de larvale epidermis om de volwassen buik segmenten te genereren. Deze verbeelding cellen, geboren tijdens de embryogenese, bestaan ​​als laterale paren van histoblast nesten in elk abdominale segment van de larven. Vier paren van histoblast nesten aanleiding geven tot de volwassen dorsale cuticula (voorste en achterste dorsale nesten), de ventrale cuticula (ventrale nesten) en de siphonen die bij elk segment (luchtgat nesten) 4. Bij puparation, deze diploïde cellen (te onderscheiden door grootte van de grotere polyploïde larvale epidermale cellen-LEC&#39;s) beginnen met een stereotype proces van proliferatie, migratie en vervanging van de LEC&#39;s. Verschillende moleculaire en genetische tools kunnen worden gebruikt om de bijdragen van genetische pathways die betrokken zijn bij morfogenese van de volwassen buik te onderzoeken. Ultimate volwassen fenotypes zijn meestal geanalyseerd na dissectie van de volwassen buik nagelriemen. Echter, onderzoek naar de onderliggende moleculaire processen vereist immunohistochemische analyses van het popstadium epitheel, die unieke uitdagingen te presenteren. Tijdelijk dynamische morfogenese en de interacties van twee afzonderlijke epitheliale populaties (larven en verbeelding), het genereren van een kwetsbare weefsel gevoelig voor overmatig cel verlies tijdens dissectie en verdere verwerking. We hebben methoden ontwikkeld om van ontleden, fixatie, montage en beeldvorming van de Drosophila popstadium abdominem epitheel voor immunohistochemische studies die een constante hoge kwaliteit monsters geschikt zijn voor confocale of standaard fluorescentie microscopie te genereren.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antilichaam kleuring van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Poppen kunnen verbeteren genetische analyse van de volwassen buik ontwikkeling genetica. We presenteren onze protocol voor dissectie, fixatie en antilichaam kleuring van geënsceneerde<em&gt; Drosophila</em&gt; Popstadium buik.

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Dun snijden van Slice voorbereidingen voor immunohistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Productie van Weefsel Microarrays, Immunohistochemie vlekken en Digitalisering Binnen het menselijke eiwit Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

Dissectie en Plaatsing van<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...