Name: dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus
Uploaded: 2011-10-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, molekylärbiologi) för att tillhandahålla nödvändiga reagenser, inklusive Mavs - / - möss och Dr Ren Sun (University of California-Los Angeles, farmakologi och molekylär medicin ) för att tillhandahålla den bakteriella artificiella kromosom av γHV68 för denna studie.

1. Mus infektion med γHV68 <ol><li> Sex till åtta veckor gamla, könsmatchad kullsyster möss (8 till 12 möss / grupp) används för virusinfektion. Låt möss att acklimatisera över fyra hela dagar (96 timmar) efter leverans. </li><li> Protokoll steg med hjälp viruset bör utföras i ett skåp i skyddsnivå 2 (BSL2) med vanliga BSL2 försiktighetsåtgärder. </li><li> Bered virussuspension (40 till 1 x 10 5 plackbildande enheter [PFU]) av γHV68 i 30 pl sterilt PBS per mus strax före experimentet. H?...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+latency+and+its+regulation:+lessons+from+the+gamma-herpesviruses.">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li><li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li><li>Strauss, W. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+mammalian+tissues.">Preparation of genomic DNA from mammalian tissues.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).</li><li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li><li>Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+&#946;-herpesvirus+genomes+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Cloning of &#946;-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).</li><li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li></ol>

Som svar på viral infektion, de Mavs beroende medfödda immunförsvaret signaleringsvägar aktiveras för att främja produktionen av antivirala inflammatoriska cytokiner 10-14. Använda mus γHV68 som en modell virus för human onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epstein-Barr-virus 3,4, upptäckte vi att γHV68 inkräktar Mavs-IKKβ Pathway to främja viral lytisk replikering via transkriptionsaktivering 5. Använda genetiskt modifierade MEF och tekniker inom molekylär v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> Elektro-MAX DH10B kompetenta celler </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Metylcellulosa </td><td> Sigma </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP Plasmid Miniprep System </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP Plasmid Midiprep System </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

Som svar på viral infektion, utvecklar en värd olika defensiva svar, såsom aktivering medfödda immunförsvaret signalvägar som leder till antivirala cytokinproduktion 1,2. För att kolonisera värden, virus är obligat att undgå värdens antivirala svar och manipulera signalvägar. Reda ut värd-virus interaktion kommer att belysa utvecklingen av nya terapeutiska strategier mot virusinfektion. Murin γHV68 är nära besläktat med människans onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epsten-Barr-virus 3,4. γHV68 infektion i laboratoriemöss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka hela förlopp värd svar och virusinfektion in vivo som inte är tillgängliga för humana herpesvirus. I detta protokoll presenterar vi en panel av metoder för fenotypisk karaktärisering och molekylär dissekering av värd signalering komponenter i γHV68 lytisk replication både in vivo och ex vivo. Tillgången på genetiskt modifierade musstammar tillåter förhör av roller vägar värd signalering under γHV68 akut infektion in vivo. Dessutom kan mus embryonala fibroblaster (MEF) isolerades från dessa bristfälliga musstammar användas för att ytterligare dissekera roller dessa molekyler under γHV68 lytisk replikering ex vivo. Använda virologiska och molekylärbiologiska analyser kan vi lokalisera den molekylära mekanismen av värd-virus interaktion och identifiera värd och virala gener nödvändiga för viral lytisk replikering. Slutligen underlättar en bakteriell artificiell kromosom (BAC)-system införande av mutationer i den virala faktor (er) som specifikt avbryter värd-viruset interaktion. Rekombinant γHV68 bär dessa mutationer kan användas för att sammanfatta de fenotyper av γHV68 lytisk replikering i MEF brist på central värd signalering komponenter.Detta protokoll ger en utmärkt strategi för att förhöra värd-patogen interaktion på flera nivåer för ingripande in vivo och ex vivo. Nyligen har vi upptäckt att γHV68 inkräktar en medfödda immunförsvaret signalvägen för att främja viral lytisk replikering 5. Specifikt aktiverar γHV68 de novo infektion immunförsvaret kinas IKKβ och aktiverat IKKβ fosforylerar befälhavaren viral transkriptionsfaktor, replikering och transaktivator (RTA), för att främja viral transkriptionsaktivering. På så γHV68 effektivt kopplar sin transkriptionsaktivering att vara värd medfödda immunförsvaret aktiveras och därigenom underlätta viral transkription och lytisk replikering. Denna studie är ett utmärkt exempel som kan tillämpas på andra virus att förhöra värd-virus interaktion.

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus at JoVE.com

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Vi beskriver ett protokoll för att identifiera viktiga roller värd signalmolekyler i lytisk replikering av en modell herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Använda genetiskt modifierade musstammar och embryonala fibroblaster för γHV68 lytisk replikering tillåter protokollet både fenotypiska karaktärisering och molekylär förhör av virus-värd interaktioner i viral lytisk replikering.

Analysera Host-virus interaktion i Lytisk Replikering av en modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Identifiera oreglerad Gener som framkallas av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekera Innate Immun Signalering i Viral Evasion av cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ett protokoll för Analysera hepatit C-virus replikering

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Hög kapacitet analys till Phenotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion och replikering i Makrofager

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studera Microbial gemenskaperna<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em&gt; Candida albicans</em&gt; Och<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganism för att bedöma Interaktion av anaeroba bakterier med värdceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjärnbarriären Använda impedans spektroskopi: Fokus på T-cell-endotelceller interaktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissekera multi signalering proteinkomplex av Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...