Name: quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

وأيد هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من ويلكوم ترست (المرجع : 084277).

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وتستخدم على نطاق واسع الأصباغ وزير الخارجية للتحقيق في وظيفة الأعصاب الطرفية في الاستعدادات العصبية كثيرة. وقد استخدمت بصورة رئيسية لرصد مدى إما الإلتقام SV ، دوران SV أو حركية إيماس 6. بروتوكول صفها تمتد هذه الدراسات لدراسة الفرق تفريغ أحواض SV محددة. وهذا يوفر معلومات إضافية بخصوص تجديد حمامات SV وكذلك مداها التعبئة. ويمكن استخدام الأصباغ وزير الخارجية لتسمية جولات متعددة من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه. استغلت هذه الخاصية ونحن تصميم البروتوكولات التي يمكن رصدها SV دوران في كل محطة طرفية مرتين في العصب نفسه. هذا يتيح مراقبة دقيقة الداخلية ، وهو أمر ضروري نظرا للطبيعة غير متجانسة من إعادة التدوير في محطات SV العصبية الموازية 11. عبر استخدام المرحلة S1 باعتبارها الرقابة الداخلية ، وإعادة تعبئتها من RRP ، RP واجمالىيمكن SV تجمع في وجود مخدرات موثوق بها ومباشرة مقارنة. بالإضافة إلى توفير المعلومات عن حجم المطلقة لإعادة التدوير ، وRRP RP حمامات التحفيز في ظل ظروف مختلفة ، ويمكن لهذا البروتوكول أيضا توفير البيانات عن بعد -- 1) وتقسيم بين مركبة فضاء وRRP RP بوصفها وظيفة من تجمع التدوير ل2 ، S1 و S2) الحجم النسبي للحمامات S2 (RRP وRP) بوصفها وظيفة من مجموع بركة التدوير S1 و 3) الحجم النسبي في أي تجمع SV المعرفة في S2 بوصفها وظيفة من نفس المجموعة في S1. وهذا البروتوكول ولا سيما عدم تقديم معلومات عن حركية التفريغ ولكن ، منذ ذلك الوقت اقتناء بطيء جدا (لقياس الحركية مرات الاستحواذ يجب أن يكون سريعا بقدر الإمكان والتفريغ تلقائيا مزامنة لالتقاط الصورة). لدينا 30 هرتز 2 المحفزات ليالي يستحضر حد ما متطابقة من RRP التفريغ لالسكروز مفرط التوتر 8. منذ حجم RRPتم تعريفها بواسطة السكروز مفرط التوتر تفريغ 15 ، يمكننا أن نقول أن هذا البروتوكول افرغت كل مركبة فضاء RRP ، بالاتفاق مع الخلايا العصبية في قرن آمون الدراسات 16. تماما تقريبا استنزاف الاحتياطي التي تجمع ثلاثة قطارات من 400 المنبهات (40 هرتز كل 10 ثانية) منذ هذا التحفيز افرغت مبلغ مماثل من صبغ لنموذج (2 المحفزات مع بوكل 50 مم) التي تستنزف 95 ٪ من جميع مركبة فضاء صبغ المسمى 8،17. تقدير دقيق لحجم RRP على حد سواء وحمام سباحة احتياطي يعتمد أيضا على الحصول على المعلومات ضمن مجموعة ديناميكية الخطية للكاميرا CCD. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسيطة مزيد من التعديل. يمكن أيضا أن قوة من المحفزات التحميل تكون متنوعة لتحديد مدى نشاط الخلايا العصبية وطرق مختلفة تؤثر الإلتقام SV تجديد حوض السباحة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أكبر من دورتين من التحميل والتفريغ أن يؤديها إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في خلايا transfected إما مع أو overexpressionناقلات shRNA. نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن الثقافات العصبية الأولية ، لا بد من البروتينات وأعرب المفتاحية مع البروتينات الفلورية. فمن الضروري أن هذه العلامات الفلورية لا تتداخل مع الإشارة صبغ FM (سماوي أو استخدام البروتينات الحمراء ، على سبيل المثال). في هذه الحالة ، يمكن أيضا من الخلايا العصبية الطرفية وغير transfected transfected في نفس الحقل للعرض يمكن مقارنة كعنصر تحكم إضافية 8. في مثل هذه التجارب المقارنة بين مدى التحميل بين الاحمال وS1 S2 غير ذات قيمة تذكر ، لأن وجود اضطراب في كلتا الأحمال. يمكن تقسيم بين صبغ أحواض SV يزال من الممكن تصور ولكن 8. ودعا الصحفيين وراثية ويمكن أيضا أن تستخدم لpHluorins رصد إيماس SV الإلتقام في الثقافة والعصبية الأولية. هذه التحقيقات استخدام درجة الحموضة حساسة للبروتين الفلورية الخضراء للبيئة درجة الحموضة من المجالات اللمعية من البروتينات SV المفتاحية مثل VAMP ، وsynaptophysin VGLUT1 18 </suع&gt;. عندما تستخدم بالاقتران مع مثبطات أتباز الحويصلي ، يمكن pHluorins التقرير كلا من حركية ومدى تعبئة تجمع SV 19. النهج FM - صبغة تستند الموصوفة هنا لديه بعض المزايا على أسلوب pHluorin ، أولا ، والأصباغ وزير الخارجية تقديم معلومات عن الوضع الذي SV الإلتقام تغذي RRP وبرك الاحتياطي 8. ويمكن تسمية محددة ثانيا حمامات SV FM مع الأصباغ التي لها خصائص مختلفة الأطياف 20 وأخيرا لا يوجد أي شرط لترنسفكأيشن. يمكن الأصباغ وزير الخارجية لا توفر معلومات عن حركة المرور SV بين الراحة وإعادة تدوير حمامات SV لكن (على النقيض من pHluorins 19) ، ومنذ ذلك الحين مركبة فضاء التعريف يجب أن تكون محملة صبغ خلال الإلتقام أن تكون مرئية. وبالتالي كل من وزير الخارجية والأصباغ pHluorins لها من القوة والضعف وأقوى عندما تستخدم في تجارب مستقلة لمعالجة مسألة واحدة. صور عالية الجودة ضرورية للتحليل صحيح وreproducibالنتائج جنيه. في حين يمكن بسهولة تصحيح الانحراف الأفقي ، لا يمكن أن التجارب التي يوجد فيها انحراف في المحور Z يمكن استردادها. لهذا السبب ، فإنه من الأهمية بمكان إعادة تركيز الصور قبل البدء S1 و S2 افرغت. في الحالات عندما تسوس كبيرة الفلورسنت حدث ، يجوز تطبيق التصحيحات تسوس (عادة من خلال طرح تتبع المسجلة مسبقا من وزير الخارجية محملة الخلايا في غياب التحفيز). ومع ذلك ، فمن المقترح أن يتم تنفيذ سوى تصحيح تسوس لتمثيل رسومي وليس لاستخدامها في أي تحليل كمي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM التنقيح 3 كاميرا رقمية </td><td> كارل زايس </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> محوري Observer.A1 مجهر </td><td> كارل زايس </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> لوحات ثقافة خلية (6 آبار) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> الطرد المركزي (العالمي 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 حاضنة </td><td> هيراوس الآلات </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> الصقر أنابيب (15 / 50 مل) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75 ∞ / 0.17 الهدف </td><td> كارل زايس </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> الزجاج coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR الدولية </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> باستور ماصات زجاجية (230 نانومتر) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> غرفة التصوير </td><td> نذير </td><td> RC - 21 BRFS </td></tr><tr><td> الصفحي تدفق هود </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain الأنسجة المروحية </td><td> Mickle مختبر الهندسة المحدودة </td><td> ام تي سي / 2 </td></tr><tr><td> مصباح الزئبق </td><td> كارل زايس </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim نظام محفز كهربائي (100mV ، عرض pluse 1ms) </td><td> Digitimer المحدودة. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> مضخة نضح </td><td> واتسون ، مارلو </td><td> 313S </td></tr><tr><td> المصلية الماصات (5/10/25 مل) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> مصراع تحكم </td><td> كارل زايس </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> محقنة (20 مل) </td><td> Plastipak دينار بحريني </td><td> ST01 - B002 </td></tr><tr><td> مرشحات حقنة (Minisart -- 0.20 ميكرون) </td><td> سارتوريوس Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC - 6 صمام تحكم القناة ستة </td><td> نذير </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filteص مجموعة (مجموعة 46) </td><td> كارل زايس </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. معينة والمعدات والأجهزة المستخدمة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> FM1 - ​​43 </td><td> كامبردج العلوم الاحيائية </td><td> BT70021 </td><td> 10 ميكرومتر </td></tr><tr><td> FM2 - 10 </td><td> كامبردج العلوم الاحيائية </td><td> BT70044 </td><td> 100 ميكرون </td></tr><tr><td> بولي - D - يسين </td><td> سيغما </td><td> P7886 </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> سيليكون الشحوم </td><td> سيغما </td><td> 85403 </td><td align="center"> -- </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الكواشف المستخدمة محددة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> مصل بقري الزلال (BSA) </td><td> سيغما </td><td> A4503 </td><td> 0.3 ٪ </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 0.25 ٪ </td></tr><tr><td> مغSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 مل mg/100 </td></tr></tbody></table> 100ML جديدة ، تجعل لكل إعداد معقمة تصفية قبل الاستخدام الجدول 3. حل باء لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> الحل B </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 19 مل </td></tr><tr><td> التربسين (5 ملغ / مل الأسهم ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> T9201 </td><td> 1 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 4. تي حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> حل C </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 3.2 مل </td></tr><tr><td> الحل B </td><td align= &quot;مركز&quot;&gt; -- </td><td align="center"> -- </td><td> 16.8 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 5. W حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز ، 500 مل يو للسهم 0.5 ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> D5025 </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> الحل B </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> فول الصويا التربسين المانع (SBTI ، و 0.5 ملغ في الأسهم مل 0.5 ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> T9003 </td><td> 0.5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 6. C حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> مصل بقري الزلال (BSA) </td><td> سيغما </td><td> A4503 </td><td> 4 ٪ </td></tr><tr><td> ايرل محلول الملح المتوازن (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 3 مم </td></tr></tbody></table> الجدول 7. EBSS الحل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> السيتوزين β - D - arabinofuranoside (آرا - C) * </td><td> سيغما </td><td> C1768 </td><td> 10 ميكرومتر </td></tr><tr><td> Foetal المصل البقري </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10 ٪ </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 30 ملم </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> سيغما </td><td> G3126 </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما </td><td> P5405 </td><td> 25 ملم </td></tr><tr><td> متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> البنسلين (ف) / الستبرتوميسين (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> يو 100 / مل (P) ، و 100 ميكروغرام / مل (S) </td></tr></tbody></table> * ينبغي أن يضاف آرا - C والمتوسطة ابتداء من 1 DIV الجدول 8. الثقافة وسائل الإعلام لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> الإصدار </th><th> شركة </th></tr><tr><td> AxioVision ريلاش. </td><td> 4.8 </td><td> كارل زايس </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> المعاهد الوطنية للصحة </td></tr><tr><td> مايكروسوفت اكسل </td><td> 2003 </td><td> مايكروسوفت </td></tr></tbody></table> الجدول 9. برامج محددة الكمبيوتر المستخدمة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> سيغما </td><td> C7902 </td><td> 1.3 ملي </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 5 مم. </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما </td><td> P5405 </td><td> 3.5 ملم </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> سيغما </td><td> P9791 </td><td> 0.4 ملي </td></tr><tr><td> 2 · MgCl 6H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M0250 </td><td> 1.2 ملم </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 مم </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 مم. </td></tr><tr><td> غ 2 SO 4 </td><td> BDH وازم المختبرات </td><td> 10264 </td><td> 1.2 ملم </td></tr><tr><td> TES </td><td> سيغما </td><td> T1375 </td><td> 20 ملي </td></tr></tbody></table> الجدول 10. محلول ملحي (7.4 درجة الحموضة)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

بعد الافراج العصبي في المحطات العصبية المركزية ، ويتم استردادها بسرعة بواسطة مركبة فضاء الإلتقام. ثم يتم تعبئتها مع مركبة فضاء استرجاع العصبي والانضمام إلى التجمع إعادة التدوير ، على النحو المحدد مركبة فضاء التي تتوفر ل1،2 إيماس. عموما يمكن إعادة تدوير تجمع تقسم الى قسمين حمامات متميزة -- تجمع نشره بسهولة (RRP) ، وتجمع إماراتي (RP). كما يعني أسمائهم ، ويتكون من مركبة فضاء RRP التي يتم على الفور المتاحة للاندماج في حين يتم إطلاق مركبة فضاء RP 1،2 فقط خلال التحفيز مكثفة. فمن المهم أن يكون هناك فحص تقارير موثوقة تفيد بأن عملية التجديد هذه الفرق حمامات SV من أجل فهم 1) كيف مركبة فضاء بعد مرور أنماط مختلفة من الإلتقام (مثل clathrin التي تعتمد على الإلتقام والنشاط التي تعتمد على الإلتقام بالجملة) و 2) الآليات السيطرة على تعبئة RRP على حد سواء وRP استجابة لمحفزات مختلفة. الأصباغ وزير الخارجية وتوظف بشكل روتينياد تقرير لدوران SV كميا في المحطات العصب المركزي 3-8. لديهم ذيل مسعور المحروقات التي تسمح بتقسيم عكسها في طبقة ثنائية المادة الدهنية ، ورئيس المجموعة للماء الذي يمنع المرور عبر الأغشية. الأصباغ ومضان قليلا في محلول مائي ، ولكن عوائدها الكم يزيد بشكل كبير في الغشاء عند تقسيم 9. هكذا هي الأصباغ FM تحقيقات الفلورسنت مثالية لتتبع بنشاط إعادة التدوير مركبة فضاء. البروتوكول القياسي للاستخدام صبغة FM هي على النحو التالي. الأولى هي تطبيقها على الخلايا العصبية ويتم تناولها خلال الإلتقام (الشكل 1). بعد غسلها غير المنضوية صبغة بعيدا عن غشاء البلازما وإعادة تدويرها ، إعادة توزيع داخل مركبة فضاء تجمع إعادة التدوير. ونضبت ثم باستخدام هذه المحفزات تفريغ مركبة فضاء (الشكل 1). منذ FM صبغة وسم مركبة فضاء غير كمي 10 ، وتراجع الناتج مضان يتناسب مع كمية من الحويصلات الافراج عنهم. وهكذا ، ولدت إعادة التدوير وانصهار مركبة فضاء من العلاقات العامةويمكن لجولة evious الإلتقام كميا بشكل موثوق به. هنا ، نقدم البروتوكول الذي تم تعديله للحصول على عنصرين إضافية للمعلومات. أولا ، يتم استخدام المنبهات متتابعة التفريغ لتفريغ بالتفاوت في RRP وRP ، والسماح الكمي لتجديد حمامات SV محددة. ثانيا ، كل محطة يمر العصب البروتوكول مرتين. وبالتالي ، يمكن مقارنة استجابة العصب نفسه في محطة S1 ضد الوجود من مادة الاختبار في المرحلة S2 (الشكل 2) ، وتوفير الرقابة الداخلية. هذا هو المهم ، لأن مدى إعادة التدوير SV عبر محطات مختلفة العصب هو متغير جدا 11. ويمكن استخدام أي ملتصقة الثقافات العصبية الأساسي لهذا البروتوكول ، ولكن يتم تحسين كثافة الطلاء والحلول والشروط لتحفيز الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) 12،13.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...