Name: quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן Wellcome (Ref: 084,277).

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

צבעים FM נמצאים בשימוש נרחב לחקור פונקציה מסוף עצב בהכנות עצבי רבים. הם היו מועסקים בעיקר כדי לפקח על היקף אנדוציטוזה או SV, מחזור SV או קינטיקה של exocytosis 6. פרוטוקול תיאר מרחיב את המחקרים הללו כדי לבחון את ההפרש פריקה של בריכות SV ספציפיים. זה מספק מידע נוסף על חידוש של בריכות SV וגם היקף הגיוס שלהם. צבעים FM ניתן להשתמש בתווית מספר סיבובים של מיחזור SV בתוך מסופי העצב אותו. אנחנו צריכים לנצל את רכוש שנועד פרוטוקולים בהם תחלופה SV בטרמינל אחד יכול להיות במעקב פעמיים מסופי העצב אותו. זה מספק בקרה פנימית מדויק, שהוא חיוני בשל אופי הטרוגני של מיחזור SV במסופי עצב מקביל 11. באמצעות שימוש של השלב S1 כמו שליטה פנימי, המילוי של RRP, RP לבין סךבריכת SV בנוכחות תרופות ניתן להשוות באופן אמין וישיר. בנוסף לאספקת מידע על גודל מוחלט של מיחזור, בריכות RRP ו RP בתנאי גירוי שונים, פרוטוקול זה יכול גם לספק נתונים הבאים - 1) חלוקת SVS בין RRP ו RP כפונקציה של הבריכה מיחזור עבור S1 ו - S2, 2) את הגודל היחסי של בריכות S2 (RRP ו RP) כפונקציה של הבריכה הכולל מיחזור S1 ו - 3) את הגודל היחסי של כל הבריכה SV S2 מוגדרת כפונקציה של הבריכה באותו S1. זה פרוטוקול מסוים לא תספק מידע על קינטיקה פריקה עם זאת, מאז הרכישה הזמן הוא איטי מדי (עבור מדידות הקינטית פעמים הרכישה צריך להיות מהיר ככל האפשר ופריקה אוטומטית מסונכרן לכידת תמונה). 30 הרץ שלנו 2 גירויים s מעורר מידה זהה של RRP הפריקה כדי סוכרוז hypertonic 8. מאז גודל RRPמוגדר על ידי סוכרוז hypertonic הפריקה 15, אנו יכולים לקבוע כי פרוטוקול זה פורק כל SVS RRP, בהסכמה עם מחקרים נוירונים בהיפוקמפוס 16. הבריכה מילואים מתרוקן כמעט לחלוטין על ידי שלוש רכבות של 400 גירויים (כל אחד 40 הרץ זה 10) מאז הגירוי הזה פורק סכום זהה של צבע על פרדיגמה (2 גירויים עם 50 מ&quot;מ KCl) כי מכלה 95% מכלל צבען שכותרתו SVS 8,17. כימות מדויק של גודל הן RRP ובמילואים בריכה תלוי גם בהשגת מידע בטווח דינאמי ליניארי של המצלמה CCD. פרוטוקול זה פשוט יכול גם להיות שונה יותר. העוצמה של גירויים טוען גם יכול להיות מגוונות כדי לקבוע כיצד הפעילות העצבית מצבי אנדוציטוזה שונה להשפיע על חידוש SV הבריכה. יתר על כן, יותר מאשר שני מחזורים של טעינה ופריקה יכול גם להתבצע אם נדרש. פרוטוקול זה יכול לשמש גם בתאים transfected עם ביטוי יתר אוshRNA וקטורים. בשל היעילות הנמוכה של תרבויות transfection עצבי ראשוני, חלבונים הביע חייב להיות מתוייגים עם חלבוני ניאון. זה חיוני כי אלה תגי פלורסנט לא להפריע לאות לצבוע FM (שימוש ציאן או חלבונים אדום, למשל). במקרה זה, מסופי עצב מתאי transfected ולא transfected באותו שדה הראייה יכול להיות גם בהשוואה בקרה נוספת 8. בניסויים כגון השוואה של מידת הטעינה בין המון S1 ו S2 הוא בעל ערך קטן, שכן ההפרעות שוהה במהלך עומסי שניהם. מחיצות של צבע בין בריכות SV עדיין יכול להיות דמיינו אולם 8. כתבים גנטית בשם pHluorins יכול גם להיות מועסק כדי לפקח exocytosis אנדוציטוזה SV ובתרבות עצבי ראשוני. בדיקות אלו להשתמש בחלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק לסביבה pH של תחומים luminal של חלבונים SV מתויג כגון נצלנית, synaptophysin ו VGLUT1 18 </sup&gt;. כאשר משתמשים בשילוב עם מעכבי שלפוחי ATPase, pHluorins יכול לדווח הן קינטיקה והיקף גיוס בריכה SV 19. הגישה FM-צבע מבוסס המתואר כאן יש כמה יתרונות על פני הטכניקה pHluorin, ראשית, צבעים FM לספק מידע על מצב שבו SV אנדוציטוזה ומחדש RRP ובריכות מילואים 8. ספציפי שנית בריכות SV יכול להיות מתויג עם צבעים FM כי יש תכונות ספקטרליות שונות 20 ולבסוף אין דרישה transfection. צבעים FM לא יכול לספק מידע על התנועה SV בין מנוחה ומיחזור בריכות SV זאת (בניגוד pHluorins 19), שכן מעצם הגדרתו SVS להיות עמוסה לצבוע במהלך אנדוציטוזה יהיו גלויים. כך גם צובעת FM ו pHluorins יש נקודות חוזק וחולשה הם החזקים ביותר כאשר מנוצל ניסויים עצמאיים לכתובת אותה השאלה. תמונות באיכות גבוהה הן חיוניות לצורך ניתוח reproducib תקףle התוצאות. בעוד להיסחף אופקי ניתן לתקן בקלות, ניסויים שבהם יש סחיפה של ציר Z-לא ניתן לשחזר. מסיבה זו, חשוב למקד מחדש את התמונות לפני תחילת פורקת S1 ו - S2. במקרים כאשר ריקבון פלורסנט משמעותי התרחש, תיקונים עששת עלול להיות מיושם (בדרך כלל על ידי הפחתת עקבות שהוקלטו בעבר מ-FM טעון תאים בהעדר גירוי). עם זאת, הוא הציע תיקון ריקבון מבוצע רק עבור ייצוג גרפי ולא לשמש עבור כל ניתוח כמותי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM הכומר 3 מצלמה דיגיטלית </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio מיקרוסקופ Observer.A1 </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> צלחות תרבית תאים (6 בארות) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 באינקובטור </td><td> Heraeus מכשירים </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות (15 / 50 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / ∞ 0.75 / 0.17 המטרה </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> זכוכית פסטר pipettes (230 ננומטר) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> הדמיה קאמרית </td><td> וורנר </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> זרימה למינרית ברדס </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain ופר רקמות </td><td> Mickle מעבדה הנדסה בע&quot;מ </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> מרקורי מנורה </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim מערכת חשמל ממריץ (100mV, 1ms רוחב pluse) </td><td> Digitimer בע&quot;מ </td><td> D330 </td></tr><tr><td> זלוף משאבה </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipettes סרולוגית (5/10/25 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> תריס בקר </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> מזרק (20 מ&quot;ל) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> מזרק מסננים (Minisart - 0.20 מיקרומטר) </td><td> סארטוריוס Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 שש שסתום ערוץ בקר </td><td> וורנר </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filter סט (סט 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ציוד מכשירים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70021 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70044 </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Poly-D-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P7886 </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סיליקון גריז </td><td> סיגמא </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 0.3% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 0.25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 מ&quot;ל mg/100 </td></tr></tbody></table> -לעשות 100 מ&quot;ל טרי להכנת כל סטרילי, מסנן לפני השימוש לוח 3. הפתרון B להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9201 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 4. פתרון T להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ג </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align= &quot;מרכז&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 5. הפתרון W עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNase, 500 U לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> D5025 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סויה מעכב טריפסין (SBTI, 0.5 מ&quot;ג לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9003 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 6. פתרון C עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> ארל פתרון מאוזן של מלח (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 3 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 7. EBSS פתרון להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> ציטוזין β-D-arabinofuranoside (ערה-C) * </td><td> סיגמא </td><td> C1768 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Foetal שור סרום </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> סיגמא </td><td> G3126 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> בינוני Essential מינימלי (מ) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין (P) / סטרפטומיצין (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(S) </td></tr></tbody></table> * ערה-C יש להוסיף בינוני מ 1 ואילך DIV לוח 8. תרבות מדיה להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> גרסה </th><th> חברה </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4.8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> המכונים הלאומיים לבריאות </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> מיקרוסופט </td></tr></tbody></table> לוח 9. תוכנת מחשב ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.3 mM </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td> 0.4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M0250 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH מעבדה ספקי </td><td> 10264 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> TES </td><td> סיגמא </td><td> T1375 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 10. תמיסת מלח (pH 7.4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

לאחר שחרור הנוירוטרנסמיטר במסופי העצבים המרכזית, SVS מאוחזרות במהירות על ידי אנדוציטוזה. SVS קטגוריה הם ומילא אז עם העצבי להצטרף בריכה מיחזור, כהגדרתו SVS הזמינים 1,2 exocytosis. הבריכה מיחזור בדרך כלל ניתן לחלק לשתי בריכות נפרדות - הבריכה releasable בקלות (RRP) ובריכת מילואים (RP). כמו שמותיהם לרמוז, RRP מורכב SVS כי הם מיד זמין עבור היתוך בעוד RP SVS משתחררים רק במהלך 1,2 גירוי עז. חשוב יש assay אמין כי הדיווחים חידוש ההפרש של בריכות אלה SV כדי להבין 1) איך SVS תנועה לאחר מצבים שונים של אנדוציטוזה (כגון אנדוציטוזה clathrin תלויי ופעילות תלויי אנדוציטוזה בתפזורת) ו 2) את המנגנונים שליטה על גיוס של שני RRP ו RP בתגובה לגירויים שונים. צבעים FM הם מעסיקים באופן שגרתיעורך הדו&quot;ח כדי כמותית מחזור SV במסופי העצבים המרכזית 3-8. יש להם זנב פחמימני הידרופובי המאפשר חלוקת הפיך ב bilayer השומנים, וקבוצה ראש הידרופילי כי מעבר אבני דרך ממברנות. צבעים יש הקרינה קטנה בתמיסה מימית, אך התשואה הקוונטים שלהם גדל באופן דרמטי כאשר למחיצות בקרום 9. כך צובעת FM הם בדיקות ניאון אידיאלי עבור מעקב פעיל מיחזור SVS. הפרוטוקול הסטנדרטי לשימוש FM לצבוע הוא כדלקמן. תחילה הם מוחלים על נוירונים נלקחים במהלך אנדוציטוזה (איור 1). אחרי לא הפנימו צבע נשטף הרחק הממברנה פלזמה, ממוחזר להפיץ SVS בתוך הבריכה מיחזור. SVS אלה מתרוקנים מכן באמצעות גירויים פריקה (איור 1). מאז FM תיוג צבען של SVS הוא quantal 10, הירידה הקרינה המתקבלת היא פרופורציונלית לסכום של שלפוחית ​​שפורסמו. לפיכך, מיחזור היתוך של SVS שנוצר יח&quot;צבסיבוב evious של אנדוציטוזה ניתן לכמת באופן מהימן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונתה כדי להשיג שני מרכיבים נוספים של מידע. ראשית, גירויים פריקה רציפים משמשים דיפרנציאלי לפרוק את RRP לבין RP, על מנת לאפשר כימות של חידוש המלאי של בריכות SV ספציפיים. שנית, כל מסוף העצב עובר את הפרוטוקול פעמיים. לכן, התגובה של המסוף העצב באותו S1 ניתן להשוות נגד הנוכחות של חומר המבחן בשלב S2 (איור 2), מתן הבקרה הפנימית. זה חשוב, שכן היקף מיחזור SV ברחבי הטרמינלים עצב שונים משתנה מאוד 11. כל התרבויות חסיד עצבי ראשוני יכול לשמש עבור פרוטוקול זה, אולם צפיפות ציפוי, פתרונות התנאים גירוי מותאמים נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) 12,13.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...