Name: quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Wellcome Trust (Ref: 084277).

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

FM красители широко используются для исследования функции нервов терминала во многих нейронов препаратов. Они были использованы главным образом для контроля степени либо эндоцитоза С. В., С. В. оборота или кинетики экзоцитоза 6. Описанные протокол расширяет эти исследования для изучения дифференциальных разгрузке конкретных С. В. бассейнов. Это дает дополнительную информацию о пополнении С. В. бассейнов, а также их степень мобилизации. FM-красители могут быть использованы для обозначения нескольких раундов С. В. переработки в пределах одного нервных окончаний. Мы использовали это свойство и предназначен протоколы, в которых С. В. оборот каждого терминала можно контролировать два раза в том же нервных окончаний. Это обеспечивает точный внутренний контроль, который необходим из-за неоднородного характера утилизации SV параллельно нервных окончаний 11. Через использование S1 фазы внутреннего контроля, заправки РРП, РП и общегоС. В. бассейн в наличии препараты могут быть надежно и напрямую сравнивать. В дополнение к предоставлению информации абсолютный размер утилизации, РРП и RP бассейны в различных условиях стимуляции, этот протокол также может предоставить данные в следующих - 1) Разделение спутников между РРП и РП в зависимости от переработки бассейн S1 и S2, 2) относительный размер S2 бассейнов (RRP и RP) в зависимости от общего числа S1 бассейн утилизации и 3) относительный размер какой-либо определенной С. В. бассейн в S2 в зависимости от одного пула в S1. Данный протокол не будет предоставлять информацию о разгрузке кинетики однако, так как время сбора данных слишком медленная (для кинетических измерений приобретения раз должно быть как можно быстрее и разгрузки автоматически синхронизированы с захвата изображения). Наш 30 Гц 2 с стимулами вызывает идентичные степени RRP разгрузки гипертонической сахарозы 8. Поскольку размер оправыопределяется гипертонической сахарозы разгрузки 15, мы можем констатировать, что этот протокол выгружает все RRP спутников, в согласии с исследованиями в нейронах гиппокампа 16. Резервного пула почти полностью истощены три поезда из 400 стимулов (40 Гц 10 с каждого), так как это стимуляция выгружает одинаковое количество красителя парадигмы (2 стимулы с 50 мМ KCl), которые истощают 95% всех красителей меченных спутников 8,17. Точная количественная оценка размера и РРП и резервный пул также зависит от получения информации в линейный динамический диапазон ПЗС-камерой. Это простой протокол также может быть изменена в дальнейшем. Сила загрузки стимулы также могут быть разнообразны, чтобы определить, каким образом активность нейронов и различные режимы эндоцитоза влияют С. В. бассейн пополнения. Кроме того, более двух циклов погрузки и разгрузки могут быть выполнены, если потребуется. Этот протокол также может быть использован в клетках, трансфицированных либо гиперэкспрессия илиshRNA векторов. Из-за низкой эффективности трансфекции первичных нейронов культур, выраженная белки должны быть помечены флуоресцентным белкам. Важно, чтобы эти флуоресцентные метки не мешали FM сигнала красителя (использование голубого или красного белков, например). В этом случае, нервные окончания от трансфицированных и не трансфекции клеток в одном поле зрения, можно также сопоставить в качестве дополнительного контроля 8. В таких экспериментах сравнение степени загрузки между S1 и S2 нагрузки не имеет большого значения, так как возмущения присутствует как во время нагрузок. Разбиение красителя между бассейнами С. В. все еще ​​может быть визуализированы Однако 8. Генетические журналистам называется pHluorins также может быть использован для контроля С. В. экзоцитоз и эндоцитоз в первичных нейронов культуры. Эти зонды использование рН-чувствительных зеленого флуоресцентного белка рН среды просвета области С. В. меченых белков, таких как VAMP, synaptophysin и VGLUT1 18 </suр&gt;. При использовании в сочетании с ингибиторами везикулярного АТФазы, pHluorins могут сообщать как на кинетику и степень мобилизации С. В. бассейн 19. FM-чернила на основе красителя Описанный здесь подход имеет некоторые преимущества по сравнению с техникой pHluorin, во-первых, FM красителей предоставить информацию о которых С. В. эндоцитоза режиме пополняется РРП и резервные бассейны 8. Во-вторых конкретные С. В. бассейны могут быть помечены FM красителей, которые имеют различные спектральные свойства 20 и, наконец, не существует никаких требований для трансфекции. FM красители не могут предоставить информацию о С. В. трафика между отдыха и переработки С. В. бассейны однако (в отличие от pHluorins 19), так как по определению спутников должны быть загружены с красителем во время эндоцитоза, чтобы быть видимыми. Таким образом, оба FM красителей и pHluorins имеют сильные и слабые стороны и наиболее эффективны, когда используются в независимых экспериментах на адрес тот же вопрос. Изображения высокого качества имеют важное значение для анализа и действительным reproducibле результаты. Хотя горизонтального дрейфа может быть легко исправлена, экспериментов, где есть дрейф в Z-оси, не могут быть восстановлены. По этой причине важно, чтобы переориентировать изображений до начала S1 и S2 разгружается. В случаях, когда значительная флуоресцентные распад произошел, распад поправки могут быть применены (как правило, путем вычитания ранее записанный след от FM-загруженных клеток в отсутствие стимуляции). Тем не менее, предполагается, что распад коррекция выполняется только для графического представления и не должны использоваться для любого количественного анализа.

<table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM Откр. 3 Цифровая камера </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 микроскоп </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Клеточные культуры пластины (6 скважин) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Центрифуга (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 инкубатор </td><td> Heraeus инструменты </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Сокол труб (15/50 мл) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20х / 0,75 ∞ / 0,17 Цель </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Стекла покровные (Ø25mm) </td><td> VWR международное </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Стекло пастер пипетки (230 нм) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Гемоцитометра </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Изображения камеры </td><td> Сигнализатор </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> Ламинарном потоке </td><td> Biohit </td><td> ОНЧ BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain тканей Chopper </td><td> Михайличенко инженерной лаборатории ООО </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Ртутные лампы </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim системы Электростимуляторы (100 мВ, 1 мс pluse ширина) </td><td> Digitimer ООО </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Перфузии насоса </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Серологические пипетки (5/10/25 мл) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Затвор контроллер </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Шприц (20 мл) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Шприц Фильтры (Minisart - 0,20 мкм) </td><td> Сарториус Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> ЭП-6 шестиканальный контроллер клапана </td><td> Сигнализатор </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP FilteГ Set (46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Специальное оборудование и аппаратуры, используемой <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Кембридж BioScience </td><td> BT70021 </td><td> 10 мкМ </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Кембридж BioScience </td><td> BT70044 </td><td> 100 мкМ </td></tr><tr><td> Поли-D-лизина </td><td> Сигма </td><td> P7886 </td><td> 15 мкг / мл </td></tr><tr><td> Силиконовая смазка </td><td> Сигма </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Конкретные реагенты, используемые <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Бычьего сывороточного альбумина (БСА) </td><td> Сигма </td><td> A4503 </td><td> 0,3% </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Сигма </td><td> G5767 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Сигма </td><td> M2773 </td><td> 1,5 мМ </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Гибко </td><td> 21300 </td><td> 960 мг/100 мл </td></tr></tbody></table> -Сделать 100 мл свежего для каждого препарата -Стерильный фильтр перед использованием Таблица 3. Раствор В для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Раствор В </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 мл </td></tr><tr><td> Трипсина (5 мг / мл акции, -20 ° С) </td><td> Сигма </td><td> T9201 </td><td> 1 мл </td></tr></tbody></table> Таблица 4. Решение T для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Решение C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3,2 мл </td></tr><tr><td> Раствор В </td><td align= &quot;Центр&quot; -&gt; </td><td align="center"> - </td><td> 16,8 мл </td></tr></tbody></table> Таблица 5. Решение Вт для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Дезоксирибонуклеазы (ДНКазы, 500 U за 0,5 фондовом мл, -20 ° C) </td><td> Сигма </td><td> D5025 </td><td> 0,5 мл </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Сигма </td><td> M2773 </td><td> 1,5 мМ </td></tr><tr><td> Раствор В </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 мл </td></tr><tr><td> Соевый ингибитор трипсина (SBTI, 0,5 мг в 0,5 мл акции, -20 ° С) </td><td> Сигма </td><td> T9003 </td><td> 0,5 мл </td></tr></tbody></table> Таблица 6. Решение С для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Бычьего сывороточного альбумина (БСА) </td><td> Сигма </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) </td><td> Гибко </td><td> 24010 </td><td> 10 мл </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Сигма </td><td> M2773 </td><td> 3 мМ </td></tr></tbody></table> Таблица 7. EBSS Решение для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> Цитозин β-D-арабинофуранозида (Ara-C) * </td><td> Сигма </td><td> C1768 </td><td> 10 мкМ </td></tr><tr><td> Плода бычьего сывороточного </td><td> Гибко </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Сигма </td><td> G5767 </td><td> 30 мМ </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Сигма </td><td> G3126 </td><td> 2 мМ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Сигма </td><td> P5405 </td><td> 25 мМ </td></tr><tr><td> Минимально необходимой среде (MEM) </td><td> Гибко </td><td> 21090 </td><td> 500 мл </td></tr><tr><td> Пенициллин (P) / стрептомицин (S) </td&gt; <td> Гибко </td><td> 15140 </td><td> 100 ЕД / мл (Р), 100 мкг / мл (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C должны быть добавлены к среде от 1 года DIV Таблица 8. Питательных сред для подготовки CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Версия </th><th> Компания </th></tr><tr><td> AxioVision Отн. </td><td> 4,8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> Национальные институты здоровья </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Таблица 9. Специальное программное обеспечение компьютера, используемого <table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог нет. </th><th> Концентрация </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Сигма </td><td> C7902 </td><td> 1,3 мм </td></tr><tr><td> Глюкоза </td><td> Сигма </td><td> G5767 </td><td> 5 мМ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Сигма </td><td> P5405 </td><td> 3,5 мм </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Сигма </td><td> P9791 </td><td> 0,4 мМ </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Сигма </td><td> M0250 </td><td> 1,2 мм </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 мм </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 мМ </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH лабораторные материалы </td><td> 10264 </td><td> 1,2 мм </td></tr><tr><td> TES </td><td> Сигма </td><td> T1375 </td><td> 20 мМ </td></tr></tbody></table> Таблица 10. Физиологического раствора (рН 7,4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Жить флуоресценции метод визуализации количественного пополнения и мобилизации конкретных синаптических везикул (SV) бассейны в центральных нервных окончаний описано. Два раунда С. В. переработки контролируются в той же нервных окончаний обеспечения внутреннего контроля.

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Внеклеточно выявления моторных нейронов для бассейна мышц Motor в<em&gt; Aplysia саЩогтса</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Экспертиза синаптических пузырьков переработка Использование FM Красители Во вызвали, спонтанный, и миниатюрных Synaptic деятельности

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Высокое разрешение Количественный Immunogold Анализ мембранными рецепторами на сетчатки синапсах ленточного

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...