Name: live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

עבודה בקבוצה של JWV נתמך על ידי מארי קירי של האיחוד האירופי Reintegration המלגה, גרנט Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), אופק מענק (ZonMW) ועל ידי מלגה VENI (NWO-ALW). הקבוצה של OPK נתמכת על ידי מספר מענקים STW (NWO), SYSMO1 (IGdeJ) ו SYSMO2 מענק, Eurocores ESF SynBio מענק (SynMod) ועל ידי המרכז Kluyver עבור Genomics של תסיסה תעשייתי במכון מובילות המזון והתזונה.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניגוד אחרים טכניקות רבות תא בודד, בשיטה זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ההיסטוריה של תא ספציפי לגבי אבותיה, התנהגותה, אירועים חלוקה. בשילוב עם היזמים היעד או חלבונים שכותרתו fluorescently, מסלול ספציפי ההפעלה התפתחותית ניתן בעקבות בזמן ולוקליזציה חלבון, כמו גם הדינמיקה חלבון יכול להיות פיקוח במהלך התפתחות חיידקים. כפי שצוין לעיל, מחקרים להתרכז מיני חיידקים שונים ניתן לבצע על ידי התאמת תנאי הגידול בהתאם לדרישות עבור חיידק ספציפי. המגבלות רק נתקלנו קשורות התנאים לצמיחה גודל המדגם. בשל הסביבה אטום, התנאים בינוני לא ניתן לשנות במהלך הניסוי. יתר על כן, לכל היותר ארבעה זנים לכל ניסוי ניתן לפקח ביעילות. בהתחשב כמה צעדים קריטיים, שיטת הניתוח תא יחיד המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם באמצעות כל מיקרוסקופ אוטומטיות. בחלק הבא, סקירה של השלבים הקריטיים תינתן. מידע מפורט ניתן למצוא את הטקסט העיקרי הכנה כללי:. רצוי לבדוק את הגדרות פוקוס אוטומטי נדרש חיידק ספציפי לפני הניסוי. כמו כן, הגדרות אופטימליות המשוער עבור להדמיה של הקרינה יש לקבוע מראש, אם אפשר. יתר על כן, לאחר שהוכן קו הזמן עוזר לקבל את כל החומר מוכן לשימוש בזמן (לפני ההתחממות קאמרית מיקרוסקופ, תכנות ההגדרות מיקרוסקופ, בהכנת שעה שקופית אחת לפני התאים נמצאים בשלב הצמיחה הרצוי, ראה תרשים 1) . הצמיחה של B. subtilis ב TLM ו CDM: TLM ו CDM מוגדרים כימי התקשורת הרעבה שבו B. subtilis רק גדל לאט. זמן התקופה שבה התאים גדלים בתקשורת עלול להיות ממושך בהתאם לזן הספציפי. הצמיחה האיטי מונע תאים נערמים אחד על השני הכנת המדגם מיקרוסקופ:. בועות אוויר בין מסגרת הגן, את השקופית זכוכית לכסות את הפתק צריך להיות מונע על מנת למנוע ייבוש נרחב של המדיום agarose מבוסס. הוא הדין ממשק בינוני / לכסות את הפתק. זה חיוני כדי לאפשר לתאים יבש מספיק, כדי למנוע שחייה ו / או צמיחה שכבת מרובים זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי:. טרום ההתחממות של השקופית, כמו גם את חדר הסביבה הוא חיוני כדי למנוע בעיות פוקוס מרכזי. תאים יש לבחור באמצע כרית אגר, שכן אלה יש את הסיכוי הגבוה ביותר להישאר בתחום ולהתמקד במהלך הניסוי (בתנאי המדגם היה יבש מספיק טוב). עד 10 מקומות לכל הניסויים עדיין עובד כמו שצריך. לאחר שנבחר על התא הראשון עניין רק להשתמש בתוכנה כדי לכוון את המיקוד (ראה טקסט לפרטים נוספים). בדוק אם התאים הם עדיין להתמקד במהלך השעות הראשונות של הניסוי ב 30 דקות במרווחים ניתוח:. חשוב לבדוק לפני ניתוח ההליכים הוארכה אם הרקע של המדיום יש ערכים דומים בערוצים פלואורסצנטי. חלקיקי אבק קטנים, רכיבים בינוני, עדשות מלוכלך או גושים זעירים agarose יכול לתרום הקרינה גדל באופן מקומי, מה שהופך את הסרט קשה או בלתי אפשרי לנתח בעיות הירי:. אם התאים לגדול על גבי אחד את השני, זה עלול גם להצביע על כך coverslip היה מצורף מוקדם מדי או כי המדיום אינו מתאים לצמיחה של monolayers microcolony. אם התאים עניין ברציפות למות בטרם עת, ואילו בתאים אחרים בשקופית לחלק בשמחה, אולי כדאי לך לבדוק אם אתה שם את UV-מסנן במצב. זה יכול גם לעזור כדי להקטין את זמן החשיפה או עוצמת האור במהלך הניסויים הארוך.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ג&#39;ין מסגרת </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1.7 x 2.8 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> רזולוציה גבוהה נמוך ההיתוך agarose </td><td> סיגמא </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> מכסה גדול להחליק </td><td> מספר </td><td></td><td> 24 x 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אם רוצים, קרום צבע, למשל FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> צבעים קרום אחרים זמינים גם: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> זמן לשגות מיקרוסקופ עם תא סביבתי </td><td> מספר </td><td></td><td> לראות את הפרטים של המכשיר שלנו בסעיפים המתאימים </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

במהלך השנים האחרונות הפך מדענים מודעים יותר ויותר כי נתונים שהתקבלו בניסויים הממוצע באוכלוסייה חיידקים מבוסס אינם נציג מעמד התנהגות, או הפנוטיפ של תאים בודדים. בעקבות תובנה חדשה זו מספר מחקרים תא בודד עולה בהתמדה (עבור הסקירות האחרונות לראות 1,2,3). עם זאת, רבים של טכניקות תא בודד להחיל אינם מאפשרים מעקב אחר התפתחות והתנהגות של תא אחד בודד מסוימת בזמן (cytometry זרימת למשל או במיקרוסקופ רגיל). כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה מיקרוסקופית שימוש במחקרים האחרונים מספר 4, 5, 6, 7, אשר מאפשר הקלטה הבאים (הקרינה של) תאים חיידקיים בודדים של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות צמיחה וחלוקת במשך דורות רבים. הסרטים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי לבנות שושלת עצים פילוגנטי על ידי התחקות בחזרה את ההיסטוריה של תא בודד בתוך אוכלוסיה שמקורם מאב קדמון משותף אחד. זמן לשגות זה מיקרוסקופ פלואורסצנטי השיטה יכולה לשמש לא רק לחקור, צמיחה חלוקה והתמיינות של תאים בודדים, אלא גם לנתח את ההשפעה של ההיסטוריה התא ממוצא על התנהגות סלולרית ספציפית. יתרה מכך, זמן לשגות מיקרוסקופ הוא אידיאלי לבחון ביטוי גנים הדינמיקה לוקליזציה חלבון במהלך מחזור תא החיידק. השיטה מסביר כיצד להכין את תאים חיידקיים ולבנות את השקופית מיקרוסקופ כדי לאפשר את תולדה של תאים בודדים לתוך microcolony. בקיצור, תאים בודדים הם הבחינו על משטח מוצק למחצה המורכב בינוני צמיחה בתוספת agarose שבו הם גדלים ומתחלקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך חדר מבוקר טמפרטורה סביבתיים. תמונות נלכדים במרווחים ספציפיים מנותחים מאוחר יותר בעזרת תוכנות קוד פתוח ImageJ.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...