Name: live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00
Duration: 7 min 31 s
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Il lavoro nel gruppo di JWV è supportata da un Marie-Curie dell&#39;UE reintegrazione Fellowship, una sovvenzione Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), un orizzonte di finanziamento (ZonMW) e da una borsa di studio VENI (NWO-ALW). Il gruppo di OPK è supportato da diversi concede STW (NWO), un SYSMO1 (IGdeJ) e SYSMO2 sovvenzione, FSE Eurocores SynBio concedere (SynMod) e dal Centro di Genomica Kluyver di Fermentazione Industriale e l&#39;Istituto superiore per Alimenti e la Nutrizione.

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	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

A differenza di molte altre tecniche singola cellula, il time-lapse metodo di microscopia a fluorescenza qui descritto può essere usato per seguire la storia di una cella specifica in relazione ai suoi antenati, il suo comportamento, e gli eventi divisione. In combinazione con i promotori bersaglio fluorescente o proteine, specifica attivazione della via di sviluppo può essere seguito in tempo e la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica delle proteine ​​può essere monitorato durante lo sviluppo dei batteri. Come indicato sopra, gli studi concentrandosi su diverse specie batteriche possono essere eseguite da adattare le condizioni di crescita a seconda delle esigenze di un batterio specifico. Le uniche limitazioni che abbiamo incontrato sono legati alle condizioni di crescita e la dimensione del campione. A causa di un ambiente sigillato, le condizioni di media non può essere modificato durante l&#39;esperimento. Inoltre, un massimo di quattro ceppi per esperimento può essere monitorato in modo efficiente. Considerando a pochi passi critico, l&#39;unico metodo di analisi delle cellule qui descritto può essere facilmente applicato con qualsiasi microscopio automatizzato. Di seguito, una panoramica di tali passaggi critici sarà dato. Informazioni dettagliate si possono trovare nel testo principale generali di redazione:. E &#39;consigliabile controllare le impostazioni di messa a fuoco automatica richieste per un batterio specifico prima dell&#39;esperimento. Allo stesso modo, approssimativo impostazioni ottimali per la visualizzazione della fluorescenza deve essere determinato in anticipo, se possibile. Inoltre, a seguito di un pronto time-line consente di avere tutto il materiale pronto per l&#39;uso nel tempo (pre-riscaldamento della camera di microscopio, la programmazione delle impostazioni microscopio, preparazione del vetrino uno ora prima che le cellule sono in fase di crescita desiderata, vedi figura 1) . crescita di B. subtilis in TLM e CDM: TLM e CDM sono chimicamente supporto definito la fame nel quale B. subtilis si sviluppa solo lentamente. Il periodo di tempo in cui vengono coltivate le cellule del supporto potrebbe essere prolungata a seconda del ceppo specifico. La crescita lenta impedisce alle cellule di accumulano l&#39;uno sull&#39;altro Preparazione del campione microscopio:. Bolle d&#39;aria tra la struttura del gene, il vetrino e la polizza di copertura devono essere prevenuti contro l&#39;essiccamento estensivo del agarosio-based media. Lo stesso vale per il medio / coperchio interfaccia slittamento. E &#39;fondamentale lasciare le pile a secco a sufficienza, per evitare che il nuoto e / o di crescita dello strato più Time-lapse microscopia a fluorescenza:. Pre-riscaldamento della diapositiva e la camera ambientale è fondamentale per prevenire problemi di messa a fuoco automatica più importanti. Le cellule dovrebbero essere selezionati nel bel mezzo di un tampone agar, dato che questi hanno la più alta possibilità di soggiornare in campo e mettere a fuoco durante l&#39;esperimento (a condizione che il campione è stato asciugato abbastanza bene). Un massimo di 10 posizioni per esperimenti funziona ancora correttamente. Dopo aver selezionato la prima cella di interesse solo utilizzare il software per regolare la messa a fuoco (vedi testo per i dettagli). Verificare se le cellule sono ancora a fuoco durante le prime ore della sperimentazione in intervalli di 30 min. Analisi: E &#39;importante controllare prima di procedure di analisi estese se lo sfondo del mezzo ha valori simili nei canali di fluorescenza. Piccole particelle di polvere, i componenti di media, lenti sporche o piccoli grumi agarosio può contribuire ad un aumento della fluorescenza a livello locale, rendendo il film difficili o impossibili da analizzare guasti:. Se le cellule crescono uno sopra l&#39;altro, questo potrebbe indicare che sia stato il coprioggetto attaccato troppo presto o che il mezzo non è adatto per la crescita di monostrati microcolony. Se le cellule di interesse continuamente muoiono prematuramente, mentre altre cellule sul vetrino divide felicemente, si potrebbe desiderare di controllare se si inserisce il filtro UV in posizione. Si potrebbe anche contribuire a diminuire il tempo di esposizione o l&#39;intensità della luce durante gli esperimenti a lungo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gene Telaio </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 centimetri </td></tr><tr><td> ad alta risoluzione a bassa fusione agarosio </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> fodera grande </td><td> parecchi </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> se lo si desidera, membrana tintura, ad esempio, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> coloranti membrana altri sono disponibili anche: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscopio con camera ambientale </td><td> parecchi </td><td></td><td> vedi i dettagli per il nostro dispositivo in sezioni corrispondenti </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Nel corso degli ultimi anni gli scienziati è diventato sempre più consapevole che i dati medi ottenuti da esperimenti popolazione microbica base non sono rappresentativi dello stato di comportamento, o fenotipo delle cellule singole. A causa di questa nuova visione del numero di studi singola cellula aumenta continuamente (per una rassegna recente si veda 1,2,3). Tuttavia, molte delle tecniche applicate singola cellula non consentono il monitoraggio dello sviluppo e il comportamento di una specifica cella singola nel tempo (ad esempio, citometria a flusso o microscopia standard). Qui, fornire una descrizione dettagliata di un metodo di microscopia utilizzato in diversi studi recenti 4, 5, 6, 7, che consente i seguenti e la registrazione (fluorescenza) singole cellule batteriche di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae attraverso la crescita e la divisione per molte generazioni. I film risultante può essere usato per costruire alberi filogenetici lignaggio da ripercorrere la storia di una singola cella all&#39;interno di una popolazione che ha avuto origine da un antenato comune. Questo time-lapse metodo di microscopia a fluorescenza non può essere utilizzato solo per studiare la crescita, la divisione e la differenziazione delle cellule individuali, ma anche per analizzare l&#39;effetto della storia delle cellule e ascendenza su specifici comportamento cellulare. Inoltre, microscopia time-lapse è ideale per esaminare le dinamiche di espressione genica e localizzazione di proteine ​​durante il ciclo cellulare batterica. Il metodo spiega come preparare le cellule batteriche e di costruire il vetrino da microscopio per consentire la conseguenza di singole cellule in un microcolony. In breve, le singole celle sono macchiati di un semi-solida superficie costituita da terreno di coltura integrata con agarosio su cui crescono e si dividono con un microscopio a fluorescenza all&#39;interno di una camera a temperatura controllata ambientale. Le immagini vengono acquisiti a intervalli specifici e vengono poi analizzati utilizzando il software open source ImageJ.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

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