Name: live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00
Duration: 7 min 31 s
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Trabalho no grupo de JWV é apoiado por uma Marie-Curie UE Reintegração Fellowship, um Grant Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), a Horizon subvenção (ZonMW) e por uma bolsa VENI (NWO-ALW). O grupo de OPK é apoiado por várias bolsas STW (NWO), um SYSMO1 (IGdeJ) e SYSMO2 subvenção, as ESF EUROCORES SynBio subvenção (SynMod) e pelo Centro de Genômica Kluyver de Fermentação Industrial eo Instituto Superior de Alimentação e Nutrição.

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	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em contraste com muitas outras técnicas única célula, o lapso de tempo método de microscopia de fluorescência descrita aqui pode ser usado para acompanhar a história de uma célula específica em relação aos seus ancestrais, seu comportamento, e eventos divisão. Em combinação com os promotores alvo fluorescente etiquetado ou proteínas, a ativação via específica de desenvolvimento podem ser acompanhadas em tempo e localização de proteínas assim como a dinâmica de proteínas podem ser monitorados durante o desenvolvimento de bactérias. Como indicado acima, os estudos concentrando-se em diferentes espécies bacterianas pode ser realizada através da adaptação das condições de crescimento de acordo com os requisitos para uma bactéria específica. As únicas limitações que encontramos estão relacionados com as condições de crescimento e tamanho da amostra. Devido a um ambiente fechado, condições médias não podem ser alterados durante o experimento. Além disso, um máximo de quatro cepas por experimento pode ser monitorado de forma eficiente. Considerando-se a poucos passos de crítica, o método de análise única célula descrito aqui pode ser facilmente aplicado utilizando qualquer microscópio automatizado. A seguir, uma visão geral dessas etapas críticas será dado. Informações detalhadas podem ser encontradas no texto principal preparação geral:. É aconselhável verificar as definições de focagem automática necessários para uma bactéria específica antes do experimento. Da mesma forma, aproximar as configurações ideais para a visualização de fluorescência deve ser determinado de antemão, se possível. Além disso, seguindo uma linha do tempo preparado ajuda a ter todo o material pronto para ser usado em tempo (pré-aquecimento da câmara de microscópio, as configurações de programação microscópio, preparando o slide uma hora antes que as células estão em fase de crescimento desejado, ver Figura 1) . Crescimento do B. subtilis no TLM e MDL: TLM e MDL são quimicamente definido media inanição em que B. subtilis só cresce lentamente. O período de tempo no qual as células são cultivadas em meios de comunicação pode ter que ser prolongado, dependendo da cepa específica. O lento crescimento impede que as células de empilhar uns sobre os outros Preparação da amostra do microscópio:. Bolhas de ar entre a estrutura genética, a lâmina de vidro ea lamínula tem que ser prevenida para evitar a secagem extensiva do meio agarose-based. O mesmo vale para a interface de deslizamento médio / tampa. É crucial para permitir que as células seco o suficiente, para evitar a natação e / ou crescimento de múltiplas camadas lapso de tempo de microscopia de fluorescência:. Pré-aquecimento do slide, bem como a câmara ambiental é crucial para evitar problemas de focagem automática principais. Células devem ser selecionados no meio de um bloco de ágar, uma vez que estes têm a maior chance de ficar no campo e foco durante o experimento (desde que a amostra foi seca bem o suficiente). Um máximo de 10 locais por experiências ainda funciona corretamente. Depois de ter seleccionado a primeira célula de interesse apenas usar o software para ajustar o foco (ver texto para detalhes). Verificar se as células ainda estão em foco durante as primeiras horas do experimento, em intervalos de 30 min Análise:. É importante verificar antes de procedimentos de análise estendida se o fundo do meio tem valores semelhantes nos canais de fluorescência. Pequenas partículas de poeira, componentes médio, as lentes sujas ou minúsculos pedaços de agarose podem contribuir para o aumento de fluorescência localmente, tornando o filme difícil ou impossível analisar Resolução de problemas:. Se as células crescem em cima uns dos outros, isso pode tanto indicar que a lamela foi anexado muito cedo ou que o meio não é adequado para o crescimento de monocamadas microcolony. Se as células de interesse continuamente morrem prematuramente, enquanto que outras células no slide dividir felizmente, você pode querer verificar se você colocar o filtro UV na posição. Ele também pode ajudar a diminuir o tempo de exposição ou intensidade de luz durante as experiências de comprimento.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Gene Quadro </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 centímetros </td></tr><tr><td> de alta resolução baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> lamínula grande </td><td> vários </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> se desejar, membrana tintura, por exemplo, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> corantes membrana outras também estão disponíveis: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Lapso de tempo microscópio com câmara ambiental </td><td> vários </td><td></td><td> ver detalhes para o nosso dispositivo nas secções correspondentes </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Durante os últimos anos os cientistas se tornaram cada vez mais conscientes de que os dados médios obtidos a partir de experimentos população microbiana baseada não são representativos do comportamento status, ou fenótipo de células individuais. Devido a essa nova visão o número de estudos única célula aumenta de forma contínua (para revisões recentes ver 1,2,3). No entanto, muitas das técnicas aplicadas única célula não permitem acompanhar o desenvolvimento eo comportamento de uma única célula específica no tempo (por exemplo, citometria de fluxo ou microscopia padrão). Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um método de microscopia utilizada em vários estudos recentes 4, 5, 6, 7, que permite seguir e de gravação (fluorescência) individual células bacterianas de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae através do crescimento e divisão por muitas gerações. Os filmes resultantes podem ser usados ​​para construir árvores filogenéticas linhagem traçando volta a história de uma única célula dentro de uma população que se originou de um ancestral comum. Este lapso de tempo método de microscopia de fluorescência não pode ser usado apenas para investigar a divisão, crescimento e diferenciação de células individuais, mas também para analisar o efeito da história da célula e ascendência sobre o comportamento celular específica. Além disso, lapso de tempo de microscopia é ideal para examinar a dinâmica de expressão gênica e localização de proteínas durante o ciclo celular bacteriana. O método explica como preparar as células bacterianas e construir a lâmina de microscópio para permitir que o crescimento de células individuais em uma microcolony. Em resumo, as células individuais são vistos em uma superfície semi-sólida composta por meio de crescimento suplementado com agarose em que crescem e se dividem em um microscópio de fluorescência dentro de uma câmara de temperatura controlada ambiental. As imagens são capturadas em intervalos específicos e são posteriormente analisados ​​usando o software de código aberto ImageJ.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para monitorar o comportamento de células individuais de diferentes bactérias no tempo usando automatizado de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, fornecem diretrizes como analisar as imagens de microscopia.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

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Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

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