Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door de Office of Science (BER), US Department of Energy, samenwerkingsovereenkomst nee. De-FC02-02ER63453, Microbiële het genoom van de National Science Foundation Sequencing Program (award nummers 0626826 en 0731916). Wij danken John Glass voor zijn technische expertise en advies en K. Eric Wommack voor zijn hulp bij het milieu monstername.

1. Voorbereiding van de Solutions Voor het uitvoeren van hydroxyapatiet chromatografie, moet fosfaat buffers worden voorbereid en het hydroxyapatiet moeten goed gehydrateerd. <ol><li> 1M-fosfaat-oplossing, pH 6.8: In een 1 liter fles 119.98g van natrium monobasisch oplossen in 1L steriele, DEPC behandeld H 2 O. Bereid een 1M dibasisch oplossing in een 1L fles door het oplossen van 141.96g van dibasisch in 1L van steriele, DEPC behandeld H 2 O. Combineer de mono-en di-...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

De hydroxyapatiet chromatografie methodiek hier wordt gepresenteerd is een zeer efficiënte en robuuste hulpmiddel voor de fractionering van nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages, wanneer het doel is het bestuderen van de totale nucleïnezuur samenstelling van de gemeenschap. In het algemeen zal ssDNA, RNA en dsDNA elueren uit de kolom pho fosfaatbuffer concentraties hoger dan ongeveer ~ 0en 0,40 m respectievelijk. Echter, elke bereiding van hydroxyapatiet hebben een iets andere samenstelling en elutie...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiaal Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Catalogus Nummer </th></tr><tr><td> Econo-Column </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID-pakket / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatiet </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Natriumfosfaat, monobasisch </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohydraat, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat, tweebasisch </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Watervrij, Poeder 500g </td></tr><tr><td> DEPC behandeld Water </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serologische pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polystyreen, Steriel </td></tr><tr><td> BD Falcon Centrifuge Tubes </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, Steriel </td></tr><tr><td> Fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Centrifugaal Device </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membraan </td></tr><tr><td> 20X TE-buffer, RNase vrij </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Virussen, in het bijzonder bacteriofagen (fagen) zijn de meest talrijke biologische entiteiten op Aarde 1,2. Virussen moduleren gastheercel overvloed en diversiteit een bijdrage leveren aan de recycling van voedingsstoffen, veranderen gastheercel fenotype, en beïnvloedt de ontwikkeling van zowel de gastheercel en virale gemeenschappen via de laterale overdracht van genen 3. Talrijke studies hebben gewezen op de onthutsend genetische diversiteit van virussen en hun functionele mogelijkheden in een verscheidenheid van natuurlijke omgevingen. Metagenomic technieken zijn gebruikt om de taxonomische diversiteit en functionele mogelijkheden van complexe virale assemblages, waarvan de leden bevatten enkelstrengs DNA (ssDNA), dubbelstrengs DNA (dsDNA) en RNA genotypen 4-9 te bestuderen. Huidige bibliotheek bouw-protocollen gebruikt om de milieu-DNA bevatten of RNA-bevattende virussen studie vereisen een eerste nuclease behandeling om te verwijderen nontargeted sjablonen 10. Echter, een beter begrip van het collectieve gen complement van het virus gemeenschap en virus diversiteit vraagt ​​om kennis van alle leden, ongeacht genoom samenstelling. Fractionering van gezuiverd nucleïnezuur subtypes biedt een effectief mechanisme om virale assemblages bestuderen zonder in te boeten een subset van de genetische van de gemeenschap handtekening. Hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, is werkzaam in de scheiding van nucleïnezuren, evenals eiwitten en microben, sinds de jaren 1960 11. Door gebruik te maken van de lading interactie tussen de positief geladen Ca 2 + ionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaat ruggengraat van het nucleïnezuur subtypen, is het mogelijk om bij voorkeur elueren elk nucleïnezuur subtype onafhankelijk van de anderen. We hebben onlangs in dienst van deze strategie om zelfstandig te fractioneren van de genomen van ssDNA, dsDNA-en RNA-bevattende virussen ter voorbereiding van de DNA-sequencing 12. Hier presenteren we een methode voor de fractionering en herstel van de ssDNA, dsDNA-en RNA-virale nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages met behulp van hydroxyapatiet chromotografie.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door &quot;Acufection&quot; en de toepassing ervan op Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...