Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Office of Science (BER), US Department of Energy, Cooperative Agreement nicht unterstützt. De-FC02-02ER63453, die National Science Foundation Mikrobielle Genome Sequencing Program (Auszeichnung Zahlen 0626826 und 0731916). Wir danken John Glass für seine technische Kompetenz und Beratung und K. Eric Wommack für seine Unterstützung bei der Umwelt-Probenentnahme.

1. Herstellung von Lösungen Vor der Durchführung Hydroxyapatit-Chromatographie, muss Phosphatpuffer hergestellt werden und die Hydroxyapatit muss richtig hydratisiert. <ol><li> 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8: In einem 1L Flasche auflösen 119.98g Natriumphosphat einbasigen in 1L steril, DEPC-behandeltem H 2 O. Bereiten Sie eine 1M Natriumdihydrogenphosphat-Lösung in einem 1L Flasche durch Auflösen von 141.96g von Natriumdihydrogenphosphat in 1L steril, DEPC-behandeltem H 2...

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	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

Die Hydroxyapatit-Chromatographie-Methodik präsentiert hier ist eine hocheffiziente und robustes Werkzeug für die Fraktionierung von Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen, wenn das Ziel, die gesamte Nukleinsäure Zusammensetzung der Gemeinde-Studie ist. Im Allgemeinen wird ssDNA, RNA und dsDNA aus der Spalte pho-Phosphat-Puffer-Konzentrationen von mehr als etwa ~ 0und 0,40 M bzw. eluieren. Allerdings kann jeder Zubereitung von Hydroxyapatit haben eine etwas andere Zusammensetzung und Elutionsprofil...

<table border="1"><tbody><tr><th> Material Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Econo-Column </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID-Paket / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatit </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Sodium Phosphate, Einbasisches </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohydrate, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Wasserfrei, Pulver 500g </td></tr><tr><td> DEPC-behandeltem Wasser </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serologische pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polystyrol, steril </td></tr><tr><td> BD Falcon Zentrifugenröhrchen </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, steril </td></tr><tr><td> Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Kreiselpumpen Geräte </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30-Membran </td></tr><tr><td> 20X TE-Puffer, RNase-frei </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Viren, vor allem Bakteriophagen (Phagen), sind die zahlreichen biologischen Einheiten auf der Erde 1,2. Viren modulieren Wirtszelle Fülle und Vielfalt, um den Kreislauf der Nährstoffe beitragen, zu verändern Wirtszelle Phänotyp, und Einfluss auf die Entwicklung der beiden Wirtszelle und Virus-Communities durch die seitlichen Transfer von Genen 3. Zahlreiche Studien haben die erstaunliche genetische Vielfalt der Viren und ihre funktionelle Potenzial in einer Vielzahl von natürlichen Umgebungen hervorgehoben. Metagenom Techniken wurden verwendet, um die taxonomische Diversität und funktionale Potenzial von komplexen viralen Assemblagen, deren Mitglieder enthalten Einzelstrang-DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und RNA-Genotypen 4-9 studieren. Aktuelle Bibliothek Bau-Protokolle verwendet werden, um Umwelt-DNA-haltigen oder RNA-Viren enthalten Studie erfordern eine erste Nuklease Behandlung zur Entfernung nontargeted Templates 10. Allerdings erfordert ein umfassendes Verständnis des kollektiven Gen Ergänzung des Virus-Community und Viren Vielfalt Wissen aller Mitglieder, unabhängig von Genom Zusammensetzung. Die Fraktionierung des gereinigten Nukleinsäure-Subtypen bietet einen wirksamen Mechanismus, durch die virale Assemblagen, ohne dabei eine Teilmenge der Gemeinde genetische Signatur zu studieren. Hydroxyapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, hat in der Trennung von Nukleinsäuren, sowie Proteine ​​und Mikroben eingesetzt worden, seit den 1960er Jahren 11. Durch die Ausnutzung der Ladungs-Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Ca 2 +-Ionen des Hydroxylapatit und der negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäure-Subtypen, ist es möglich, bevorzugt eluieren jede Nukleinsäure-Subtyp unabhängig von den anderen. Vor kurzem haben wir diese Strategie, unabhängig fraktionieren die Genome von ssDNA, dsDNA und RNA-Viren enthalten in der Vorbereitung der DNA-Sequenzierung 12 verwendet. Hier stellen wir ein Verfahren zur Fraktionierung und Rückgewinnung von ssDNA, dsDNA und RNA viralen Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen mit Hydroxyapatit-Chromatographie.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Wir beschreiben eine effiziente Methode, um Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA-und RNA-Molekülen aus Umwelt-virale Gemeinden zu trennen. Nukleinsäuren sind fraktionierte mit Hydroxyapatit-Chromatographie mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-haltigen Puffer. Diese Methode erlaubt die Isolierung aller viralen Nukleinsäure-Typen aus Umweltproben.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...